El metedo de numero mas probable

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EL METODO DE NUMERO MÁS PROBABLE

Es una estrategia eficiente de estimación de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible.

La técnica se basa en la determinación de presencia o ausencia (positiva o negativo) en replicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en las muestras. Un requisito importante de este método es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la población en el medio de crecimiento a utilizarse.

El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabilística.

Algunas de las ventajas del NMP son:

La capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo se pueden determinar la densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en una muestra de suelo usando el método de infección de plantas.

Provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de ambientes diversificados.

Determina solo organismos vivos y activos metabolitamente.

Suele ser mas rápido e igual de confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo, entre otros.

Se realizan diluciones en tubos y luego sembrar cada uno en una placa, o usar una placa para todas las diluciones de una muestra.

Materiales y equipos:

+Muestras ambientales (lodos, charcas, ríos, suelo)

+placas petri con medio de crecimiento

+tubos de diluciones con 9 ml de o, 85% nacl

+micropipetas

+puntas para micropipetas

+incubadora 25ºc

+vortex

Metodología

+ Muestras: colecte asépticamente muestras frescas de suelo (10g) de varios lugares u obtenga muestras de agua (10ml) de lagos, ríos o charcas.

+extracción de microorganismos viables: para muestras de suelo, las células podrán ser removidas y homgenizadas añadiendo 1g de muestra de un tubo de ensayo que contenga 9ml de solución salina. Agite moderadamente por 5 minutos en un vortex.

+dilución en serie: el extracto de suelo puede ser diluido seriadamente transfiriendo 1ml a un tubo con 9 ml de o, 85% nacl. Cada transferencia corresponde a una dilución hasta alcanzar la dilución de 10-7 para muestras liquidas, mezcle bien la muestra y proceda a preparar las diluciones seriadas como fueron descritas anteriormente.

+placas petri: utilizando un marcador, divida la placa en 5 zonas de igual tamaño. Use una placa para cada muestra. Rotule cada zona con el factor de dilución a ser inoculado.

+inoculación: transfiera 5 ul de la dilución apropiada al área correspondiente repita esta operación 5 veces por cada dilución.

+ permita que el incoculo seque sobre el medio de crecimiento: selle la placa con un trillade parafina. Invierta la placa e incube a 25ºc por 7 días.

+ evaluación de crecimiento: para cada dilución en ascendencia evalúe el crecimiento o no crecimiento sobre cada replica incoculada. Reporte los resultados como se indican en el ejemplo a continuación: diluciones 10-3-10-4-10-5-10-6-10-7:5-5-3-2-0.  

CULTIVOS PUROS

En microbiología debido a la pequeñez de las bacterias no se puede trabajar con una célula o un individuo si no por el contrario con poblaciones de bacterias. Cuando estas poblaciones están compuestas de una sola especie microbiana se habla de cultivo puro.

Se define como cultivo puro aquel que solo contiene una clase de microorganismo y que se ha originado a partir de una sola célula.  No es requisito que todas las células que componen un cultivo puro sean totalmente idénticas, es posible que algunas de ellas sufran mutaciones y se diferencien por ello ligeramente de las restantes.

Los cultivos cuyas características principales son semejantes se agrupan en especies y cada uno de los cultivos puros que componen estas especies se denomina cepas.

El primer paso para el estudio microbiológico de un producto determinado es el desglosamiento de la compleja población mixta en cultivos puros y su posterior identificación (familia, género, especie).

Método de siembra por estrías en placa petri:

Sobre la superficie de un medio sólido se deposita con un asa una pequeña cantidad de la muestra y se distribuye extendiéndola sobre ella. La extensión en superficie se hace utilizando el asa de Micron previamente esterilizada en la llama y enfriada en el agar.  De este modo se van extendiendo las bacterias sore la superficie del agar separándolas unas de otras.

Los microorganismos se adhieren sobre la superficie del medio y se multiplican formando colonias. Cada una de estas colonias se ha formado por consiguiente por la multiplicación de una sola célula. Traspasando una colonia aislada a una nueva placa de cultivo se obtendrá un cultivo puro en el cual todas las colonias deberán presentar las mismas características.

La técnica de aislamiento por estrías puede efectuarse con facilidad y con una cantidad reducida de materiales de laboratorio; es el procedimiento habitual para aislar microorganismos en cultivos puros.

Existen varias técnicas de siembra por estrías en medios sólidos:

Método A:

+ El inoculo se extiende sobre una pequeña zona cualquiera de la placa.

+ Se esteriliza el asa y se utiliza para trazar 2 estrías a partir del depósito del material. Una de las estrías se hace solo hasta el otro centro de la placa.

+ Se esteriliza de nuevo el asa y se hace una serie de estrías perpendiculares a las 2 primeras.

+ Después de esterilizar el asa una vez más se hace una serie de estrías paralelas a las 2 primeras pero partiendo del lado opuesto al depósito y procurando no llegar a tocarlo.

Método B:

+ Se deposita el inoculo en una zona cualquiera de la placa.

+ Se extiende el inoculo en forma continuada sobre la superficie del agar.

+ Si una superficie excesiva del agar queda sin usar, habrá mala distribución y el crecimiento será compacto.

Técnicas de las disoluciones seriadas:

Esta técnica puede realizarse de 2 maneras

Método de diluciones en medio liquido: con el asa de Micron se deposita una pequeña cantidad d material a partir de una suspensión bacteriana o de un cultivo mixto, a un tubo de suero fisiológico o de caldo común (A) con una pipeta Pasteur se traspasa de este tubo una pequeña cantidad de material a un segundo tubo (B) y luego de este a un tercer tubo (C).

Con una pipeta Pasteur se deposita sobre una placa petri con agar peptona virgen una gota de cada tubo y esta se extiende sobre toda la superficie del agar.

Las placas se ponen a incubar a 37ºc x 24-48h. Después de lo cual se examinan en busca de colonias aisladas las que crecen en superficie.

Para obtener cultivo puro se repica una colonia aislada a otra placa nueva de agar peptona y se incuba por 24-48h. A 37ºc.

Método de las disoluciones en agar fundido: esta técnica se realiza igual a la anterior pero las diluciones en vez de realizarlas en suero fisiológico o caldo peptona se realizan en tubo con agar peptona fundido y enfriado a 45ºc.

El contenido de cada uno de los tubos se vierte por separados en placas petri vacías y estériles. Se dejan enfriar y endurecer y se incuban a 37ºc por 24-48h. Después de lo cual se examinan para buscar colonias aisladas las que crecen tanto en superficie como en profundidad. Posteriormente se traspasa a una nueva placa de agar con el fin de obtener un cultivo puro.