Amplificación de ADN mediante PCR: Fundamentos y Protocolo

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR): Amplificación de ADN

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un procedimiento rápido para la amplificación enzimática in vitro de un segmento específico de ADN. Hay tres segmentos de ácido nucleico involucrados: el segmento de ADN de doble cadena que se amplificará y dos cebadores de oligonucleótidos de cadena sencilla que lo flanquean. Además, se requiere un componente proteico (una ADN polimerasa), desoxirribonucleósido trifosfato (dNTP), un tampón y sales.

Los cebadores se agregan en un vasto exceso en comparación con el ADN a amplificar. Estos hibridan con cadenas opuestas del ADN y están orientados con sus extremos 3' enfrentados entre sí, de modo que la síntesis por la ADN polimerasa (que cataliza el crecimiento de las nuevas cadenas 5' → 3') se extiende a través del segmento de ADN entre ellos. Una ronda de síntesis da como resultado nuevas cadenas de longitud.

El segundo ciclo de desnaturalización, alineamiento y síntesis produce dos productos monocatenarios que juntos componen un producto bicatenario discreto que tiene exactamente la longitud entre los extremos del cebador. Cada hebra de este producto discreto es complementaria a uno de los dos cebadores y, por lo tanto, puede participar como plantilla en ciclos subsiguientes. La cantidad de este producto se duplica con cada ciclo subsiguiente de síntesis, desnaturalización y recocido, acumulándose de manera exponencial, de modo que 30 ciclos deben dar como resultado una amplificación de 2²⁸ veces (270 millones de veces) del producto discreto.

La PCR simplemente consiste en mezclar ADN molde, dos cebadores oligonucleotídicos apropiados, Taq u otras ADN polimerasas termoestables, trifosfatos de desoxirribonucleósidos (dNTP) y un tampón. Una vez ensamblada, la mezcla se somete a un ciclo varias veces (generalmente 30) a través de temperaturas que permiten la desnaturalización, el alineamiento y la síntesis para amplificar exponencialmente un producto de tamaño y secuencia específicos.

Materiales Necesarios para la PCR

• Buffer de PCR 10X libre de MgCl₂
• Cebador 1: 50 µM (50 pmol/µl en agua estéril, almacenado a −20°C)
• Cebador 2: 50 µM (50 pmol/µl en agua estéril, almacenado a −20°C)
• ADN molde: 1 µg de ADN genómico 1:5
• Mezcla de 4dNTP: 25 mM
• Taq ADN polimerasa: 5 U/µl
• Agua destilada estéril libre de DNAsas
• Tubos de PCR

Ciclos de PCR

• Inicio: 95°C por 5 minutos
• Desnaturalización: 94°C por 40 segundos
• Alineamiento: 58°C por 40 segundos
• Elongación: 72°C por 1 minuto (30 ciclos)
• Elongación final: 72°C por 5 minutos
• Conservación: 4°C

Cálculo de la Master Mix

Fórmula para calcular la master mix: v1 = (c2 * v2) / c1