Amplificación del Gen ITS por PCR Convencional: Identificación Molecular de Hongos

Introducción a la Amplificación del Gen ITS por PCR Convencional

En esta sección, se detalla el procedimiento para la amplificación del gen ITS (Espaciador Transcrito Interno) mediante PCR convencional, una técnica fundamental en la identificación molecular de hongos.

El gen ITS es una región clave en la identificación molecular de hongos debido a su alta variabilidad y su ubicación estratégica entre las regiones ribosomales 18S y 28S. Esta característica lo convierte en un marcador universal en micología, ideal para diferenciar especies dentro de un mismo género y crucial para identificar especies fúngicas de importancia clínica o ambiental.

Protocolo de Amplificación del Gen ITS

Materiales y Reactivos

• ADN molde: 4 µL, previamente extraído de la muestra biológica.
• Cebadores ITS-1 e ITS-4: 1 µL de cada uno, diseñados para amplificar específicamente la región ITS.
• Mezcla ReadyMix™ Taq: 15 µL, que incluye Taq polimerasa, dNTPs y un búfer optimizado.
• Agua libre de nucleasas: 4 µL, para completar el volumen final de 25 µL.

Condiciones del Termociclador

El procedimiento en el termociclador consistió en 35 ciclos de las siguientes tres etapas:

1. Desnaturalización: a 94 °C durante 45 segundos, donde las dos hebras del ADN se separan.
2. Alineamiento: a 55 °C durante 30 segundos, permitiendo que los cebadores se unan a las secuencias complementarias del ADN molde.
3. Extensión: a 72 °C durante 1 minuto, donde la Taq polimerasa sintetiza la nueva cadena de ADN.

Finalmente, se realizó una extensión final a 72 °C durante 10 minutos para asegurar la completa duplicación de todas las moléculas de ADN. Este paso es crucial para obtener suficientes fragmentos amplificados para su posterior evaluación, como la secuenciación o la electroforesis en gel.

Conclusiones y Aplicaciones en Biología Molecular

Este proyecto permitió la identificación y el estudio de dos genes fundamentales en microorganismos: el gen ITS, como marcador universal para la identificación molecular de hongos, y el gen BenA, esencial para estudios taxonómicos y de resistencia antifúngica.

Mediante técnicas de PCR convencional, se logró la amplificación de estas regiones genéticas utilizando protocolos optimizados y herramientas como la mezcla ReadyMix™ Taq, cebadores específicos y un termociclador, facilitando la obtención de productos genéticos confiables.

Resultados Destacados

• La amplificación exitosa del gen ITS reafirma su utilidad en la caracterización molecular de hongos, especialmente en contextos ambientales y clínicos.
• La amplificación del gen BenA subraya su relevancia en la identificación precisa de especies dentro del género Penicillium y su posible vinculación con mutaciones que confieren resistencia a antifúngicos.

Impacto y Perspectivas

Estos hallazgos demuestran la indispensabilidad de las herramientas de biología molecular, como la PCR, en la microbiología moderna. Su aplicación no se limita a la identificación de microorganismos, sino que se extiende a investigaciones aplicadas en salud, biotecnología y conservación ambiental.

En síntesis, este trabajo no solo facilitó la obtención de productos genéticos de alta calidad, sino que también profundizó la comprensión de los fundamentos y aplicaciones de la amplificación génica, consolidando habilidades esenciales en biología molecular.