Aplicaciones forenses del análisis del ADN

2. Polimorfismo de secuencia

Consisten en variaciones de uno o más nucleótidos en la secuencia de un locus. Los más interesantes para la genética forense son los polimorfismos de nucleótido único (SNP): consisten en variaciones puntuales de un único nucleótido.

Normalmente son polimorfismos dialélicos y su frecuencia en el genoma humano es aproximadamente de 1 por cada 1000 nucleótidos.

La huella genética

Es la combinación de alelos de varios marcadores genéticos que posee un individuo.

Cuanto mayor sea el número de marcadores analizados y mayor sea la secuencia, el número de alelos descritos para cada marcador, mayor probabilidad de que una combinación de alelos sea única e identificable de manera inequívoca al individuo.

Se han desarrollado 3 metodologías para analizar la variabilidad genética, que representan el pasado, presente y futuro de la huella genética.

1. Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)

Primera metodología que se desarrolló para la obtención de huellas genéticas basada en el análisis de varios VNTR:

El protocolo se basa en la técnica de Southern blot:

1. Digestión con una enzima de restricción de ADN de alto peso molecular purificado, generando cientos de miles de fragmentos de ADN (alguno tendrá el VNTR concreto). El tamaño de ese fragmento variará de un individuo a otro, dependiendo del alelo.
2. Separación de los fragmentos mediante electroforesis.
3. Transferencia de los fragmentos a una membrana de nailon.
4. Hibridación con sondas radiactivas específicas de los VNTR. Pueden ser de locus único (SLP) o multilocus (MLP). Las zonas SLP únicamente detectan un VNTR, mientras que las sondas MLP son una mezcla de sondas que detectan simultáneamente varios VNTR.
5. Autorradiografía de la membrana.

El resultado final:

• Con sondas SLP se observa una o dos bandas, dependiendo de que el individuo estudiado sea homocigótico o heterocigótico.
• Con sondas MLP se obtiene un patrón de bandas característico de cada individuo. El número de bandas depende del número de VNTR analizados con la sonda.

Si la sonda cubre 10 VNTR diferentes, los patrones de bandas obtenidos tendrán entre 10 (homocigóticos) y 20 bandas (heterocigóticas). La posición de cada banda dependerá del alelo individual del VNTR.

A este patrón se le denomina huella genética.

La probabilidad de discriminación entre 2 individuos depende del número de VNTR analizados y de la variación alélica de cada uno.

El principal inconveniente es que para obtener un buen resultado hay que partir de una cantidad relativamente grande de ADN no degradado, fácil en las pruebas de paternidad; pero no en estudios de criminalística, en los que se parte de cantidades mínimas de ADN muy degradado.

2. Análisis de STR mediante PCR

La amplificación de STR mediante PCR permite trabajar con cantidades mínimas de ADN y amplificar secuencias menores de 500 nucleótidos. La degradación del ADN no influye en el resultado.

Tras amplificar, se somete a electroforesis en gel para separar por tamaño los alelos y obtener el genotipo de cada individuo analizado para ese STR.

Para facilitar la lectura del gel e identificar los alelos, en una de las calles se corre una mezcla de todos los alelos posibles de ese STR, generando una escalera alélica.

La comparación de las bandas permite la identificación directa de cada alelo. En individuos homocigóticos se da una única banda, y en los heterocigóticos, 2.

Si se analiza 1 único STR, la probabilidad de que 2 individuos tengan el mismo genotipo es superior a 1 entre 100.

Para aumentar la discriminación se analizan varios STR, de forma que las combinaciones de los patrones de bandas configuran una huella genética. Para hacer un estudio forense se amplifican 15 STR autosómicos diferentes más un marcador sexual. Con este cambio de marcadores la probabilidad es inferior a 1 entre 1 billón (huella genética única casi del 100%).

Para estandarizar los resultados de los estudios forenses y poder crear bases de datos internacionales, se han validado varios conjuntos de marcadores. El más utilizado es el CODIS, del FBI: 13 marcadores autosómicos más la amelogenina.

3 Análisis de SNP

Es el futuro de la huella genética. Representa el paso de los análisis de polimorfismo de longitud a los polimorfismos de secuencia.

2 ventajas:

• Tasa de mutación muy baja.
• Al afectar a nucleótidos únicos, la probabilidad de que estén conservados en muestras de ADN degradado es mayor.

El principal inconveniente es el bajo poder de discriminación, ya que son marcadores dialélicos, por lo que habrá que analizar miles de SNP para que tengan un poder de discriminación similar al STR.

El desarrollo de la PCR múltiple en tiempo real, las técnicas de secuenciación masiva y el diseño de microarrays, facilitan la implantación de estas técnicas de genética forense.

Análisis de ADN mitocondrial

Es un recurso interesante en estudios forenses de muestras muy antiguas, muy degradadas o en ausencia de ADN nuclear.

• Es una molécula circular más estable y resistente a la acción de las exonucleasas que el ADN nuclear lineal. Ej. restos óseos de miles de años de antigüedad.
• El número de mutaciones varía de cientos a miles, y cada célula contiene múltiples copias de ADNmt, superior al del ADN nuclear.

El ADNmt es de herencia materna, no hay diferencias entre individuos, salvo pequeñas variaciones por mutaciones.

Los estudios forenses de ADNmt se basan en polimorfismos de secuencia. La metodología consiste en amplificar y secuenciar estas regiones hipervariables para establecer comparaciones.

Análisis de polimorfismos del cromosoma Y

El cromosoma Y humano es acrocéntrico, pequeño, que casi no sufre recombinación durante la meiosis (solo una pequeña región con el cromosoma X), lo que lo hace interesante en estudios forenses, ya que casi todo el cromosoma se hereda.

El análisis se basa en polimorfismos de longitud y en STR (Y-STR).

Los Y-STR analizados se encuentran en la región no recombinada, por lo que se heredan en bloque, constituyendo un haplotipo que se mantiene en las generaciones (el único cambio posible es por mutación).

Aplicaciones:

• Estudios antropológicos
• Estudios de paternidad (si no hay padre es válido un hermano, abuelo...)
• Criminalística - delitos sexuales

El hecho de ser un haplotipo limita el estudio, por lo que es imprescindible combinar el análisis del cromosoma Y con estudios convencionales basados en polimorfismos autosómicos.

Bioinformática

Parte de la informática que utiliza herramientas computacionales para gestionar y analizar datos biológicos y médicos.