Aplicaciones y ventajas de la PCR en Medicina y Ciencias de la Salud

Usos de la PCR

• Diagnóstico clínico
• Detección de cepas resistentes a antibióticos
• Detección de mutaciones puntuales
• Polimorfismo genético
• Filiación humana
• Medicina Forense
• Pedigrí animal
• Control de calidad
• Monitoreo y Evaluación de terapia

Finalidad PCR

El gran número de copias del fragmento de ADN particular (gen) 100 a 2000 pb permite:

• Clonaciones y Secuenciaciones genes
• Diagnóstico de enfermedades virales

Ventajas

• Alta sensibilidad
• Alta especificidad
• Rapidez

Otras ventajas

• Detección a partir de cualquier muestra biológica (sangre, piel, cabellos, saliva, líquido cefalorraquídeo, etc…)
• No es necesario que la muestra sea estéril
• Detección de un patógeno en particular aún en presencia de otros patógenos.

La mezcla de reacción requiere:

• Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
  El sustrato para polimerizar nuevo ADN.
• Dos cebadores o iniciadores (primers F y R).
  Oligonucleótidos, que cada uno es complementario a una de las dos hebras del ADN (6-40 nucleótidos)
• Iones de magnesio (Mg2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2).
• Una solución tampón que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.
• ADN polimerasa o mezcla de polimerasas.
• ADN molde, que es la muestra que se va a amplificar.
• H₂O ultra pura.

Programa de amplificación

• Desnaturalización inicial (94-95ºC; 5-10 minutos)
  se activa la ADN polimerasa, en caso de necesitarlo.
• Posteriormente tiene tres pasos que se repiten entre 20 y 40 veces: 30 ciclos (entre 20-40 ciclos)
  • Desnaturalización cíclica (94ºC - 95 ºC).
  • Unión del cebador (45ºC - 65ºC).
  • Extensión de la cadena (70ºC - 74ºC).
• Extension final (72°C x 5 – 15 minutos)
• Enfriamiento sostenido a 4ºC

Tipos PCR

• RT-PCR: detección de mRNA
• PCR-RFLP: polimorfismo genético
• RAPDs: amplificación con random primers - polimorfismo
• PCR Nested: amplificación de una secuencia anidada dentro de otra previamente amplificada
• PCR Multiplex: varios blancos diferentes en forma simultánea
• Inverted PCR: para conocer secuencias flanqueadoras
• Long PCR: amplificación de fragmentos grandes 10 -20 kb.
• PCR in situ: PCR en secciones histológicas o células + hibridación in situ.