Biología Molecular: ADN Polimerasas y Clonación de Ácidos Nucleicos

Mecanismo de Acción de las ADN Polimerasas

Las **ADN polimerasas** catalizan la formación de cadenas de **polinucleótidos** mediante la adición sucesiva de **nucleótidos** que proceden de **dNTPs**. Para ello, necesitan un **molde** apropiado de **ADN**. Cada nucleótido que se incorpora forma un **par de bases** correcto con una base de ese molde. La ADN polimerasa conecta el nucleótido recién llegado con su predecesor en la cadena, añadiendo así nuevos **nucleótidos** al **extremo 3'** de una cadena de **polinucleótidos** en crecimiento.

Elementos Esenciales para la Actividad de las Polimerasas

Para que las **ADN polimerasas** puedan llevar a cabo su función, requieren los siguientes elementos:

• Un **cebador** o **primer** (un **oligonucleótido**).
• Un **ión metálico** (generalmente Mg²⁺).
• Un **molde de ADN**.
• **Nucleótidos sueltos** (desoxirribonucleótidos trifosfato o **dNTPs**).

Definición de Cebador (Primer)

Un **cebador** es un **oligonucleótido** que actúa como secuencia de inicio a partir de la cual las **ADN polimerasas** ejercerán su función de **elongación**. Estos cebadores están compuestos por **18-24 bases** y son capaces de reconocer una **secuencia complementaria** del **ADN** estudiado y unirse a ella.

Número de Cebadores Requeridos para la Elongación

Para la elongación de un fragmento de **ácido nucleico**, se utilizan **dos cebadores** (un par), uno para cada extremo de la cadena a elongar.

Actividades de las ADN Polimerasas

Actividad Polimerasa 5' → 3'

Esta actividad permite a la **ADN polimerasa** alargar el **cebador** cuando existe una **hebra molde** apropiada, sintetizando la nueva cadena de **ADN** en dirección **5' a 3'**.

Actividad Exonucleasa 3' → 5' (Proofreading)

La actividad **exonucleasa 3' → 5'** permite a la **ADN polimerasa** remover nucleótidos incorrectamente incorporados, realizando **correcciones** en caso de **distorsión** en la doble hélice. Esta función es crucial para la **fidelidad de la replicación**, ya que **elimina mutaciones** antes de que se fijen. Es importante destacar que esta actividad **no existe en muchos virus ni bacterias**, lo que contribuye a su alta **capacidad de mutación**.

Actividad Exonucleasa 5' → 3'

Esta actividad permite a la **ADN polimerasa** degradar el **cebador** (generalmente de ARN) y, en su lugar, agregar los **nucleótidos** de **ADN** correspondientes. Es una función presente en algunas polimerasas, como la **ADN Polimerasa I** en procariotas, y es esencial para la eliminación de cebadores durante la replicación y reparación del ADN.

Actividades de la ADN Polimerasa III

La **ADN Polimerasa III** es la principal enzima replicativa en Escherichia coli y posee dos actividades clave: **actividad polimerasa 5'→3'** (para la síntesis de la nueva cadena) y **actividad exonucleasa 3'→5'** (para la corrección de errores o proofreading).

Capacidad de Mutación en Virus y Bacterias

Los **virus** y las **bacterias** a menudo presentan una alta **capacidad de mutación** debido, en parte, a la **ausencia de actividad exonucleasa 3'→5'** en sus polimerasas o a una menor eficiencia de esta función. Esto significa que tienen menos mecanismos de corrección de errores durante la replicación de su material genético, lo que lleva a una mayor tasa de mutaciones.

Clonación Genética

La **clonación** es la obtención de un **clon**, es decir, de un conjunto de elementos **genéticamente idénticos** entre sí y a su precursor. Este proceso puede aplicarse a diversas entidades biológicas, incluyendo **moléculas**, **células**, **tejidos**, **órganos**, e incluso **organismos pluricelulares** completos.

Métodos de Clonación de Ácidos Nucleicos

La clonación de **ácidos nucleicos** puede realizarse de dos maneras principales:

• **Con células** (clonación celular).
• **Sin células** (clonación acelular), siendo la **PCR** (Reacción en Cadena de la Polimerasa) el ejemplo más destacado.

Tecnología del ADN Recombinante

La **tecnología del ADN recombinante** se refiere a la **clonación de moléculas** de **ácidos nucleicos** mediante un proceso **celular**. Consiste en introducir estas moléculas de **ácidos nucleicos** en **células anfitrionas** o **huéspedes** en cultivo, donde se multiplican y se expresan.

Clonación Acelular

La **clonación acelular** es un método de clonación de **moléculas** de **ácidos nucleicos** que se realiza **sin la intervención de células**. El ejemplo más conocido y ampliamente utilizado de clonación acelular es la **PCR** (Reacción en Cadena de la Polimerasa).