Biología Molecular: Enzimas de Restricción, Vectores y PCR para el Diseño de Primers

- Célula en condiciones de mitosis (anafase). Se debe romper la célula.
- Se utiliza colchicina (inhibidor de la polimerización de los microtúbulos).
- Las sondas se desnaturalizan y se hibridan con el ADN del cromosoma.

Enzimas usadas en ADN recombinante:

• * Endonucleasas de restricción tipo II: cortan el ADN en secuencias específicas.
• * ADN ligasa: une dos moléculas o fragmentos de ADN.
• * ADN polimerasa I (E. coli): rellena huecos en el ADN dúplex mediante la adición de nucleótidos en los extremos 3'.
• * Transcriptasa reversa: realiza la copia de ADN a partir de ARN.
• * Polinucleótido quinasa: añade un grupo fosfato al grupo OH del extremo 5' de un polinucleótido para marcarlo o permitir su ligación.
• * Transferasa terminal: añade colas homopoliméricas al grupo OH del extremo 3' de un dúplex lineal (añade nucleótidos).
• * Exonucleasa III: elimina nucleótidos de los extremos 3' de una hebra de ADN.
• * Exonucleasa del bacteriófago lambda: elimina nucleótidos de los extremos 5' de un dúplex para exponer extremos 3' monocatenarios.
• * Fosfatasa alcalina: elimina fosfatos terminales del 5', del 3' o de ambos. Desfosforila el vector para evitar la religación y permite agregar ADN foráneo.

ADN recombinante: molécula híbrida que posee ADN foráneo, generada por enzimas de restricción que cortan el ADN en un lugar específico, generando extremos cohesivos para que la ADN ligasa los una a un vector.

Vector: molécula transportadora que transfiere y replica fragmentos de ADN foráneo.

• * Plásmidos: ADN extracromosómico de doble hebra y circular (ej. pBR322).
• * Bacteriófago lambda: virus que infecta bacterias.
• * Cósmidos: plásmido con genoma del bacteriófago lambda.
• * BAC: cromosoma artificial bacteriano.
• * YAC: cromosoma artificial de levadura.

Vector de reemplazo: bacteriófago lambda donde su fragmento central es removido y sustituido por ADN foráneo.

Vector de inserción: bacteriófago lambda que acepta fragmentos de ADN pequeños, sin remoción del fragmento central.

Desfosforilación del vector: se realiza con fosfatasa alcalina, para evitar asociaciones intramoleculares.

Genotecas: son colecciones de clones de ADN obtenidos a partir de determinado ADN.

• * Genoteca genómica: genoteca que comprende un genoma completo.
• * Genoteca de cDNA: genoteca de cDNA obtenida a partir de un ARNm de un determinado tejido o tipo celular.
• * Genoteca de expresión: genoteca realizada con un vector que lleva señales adecuadas para provocar que cualquier inserto de ADN clonado genere un ARNm (y un producto proteico).

PCR

• * ADN molde (ADN genómico, cDNA, plasmídico)
• * ADN polimerasa termoestable
• * Primers (sentido y antisentido)
• * dNTPs: dATP + dCTP + dGTP + dTTP
• * Buffer de reacción
• * Mg²⁺: cofactor de la polimerasa y estabilizador de la hebra
• * H₂O libre de nucleasas

- Consta de 3 etapas:

1. 1. Desnaturalización del ADN para separar las hebras (94–96 °C)
2. 2. Hibridación de los primers (temperatura variable) (50–60 °C)
3. 3. Síntesis de ADN → extensión (72 °C)

Criterios clásicos para un óptimo diseño de primers

• * Especificidad: asegurar que la secuencia complementaria sea única.
• * Longitud: 17–28 bases. El rango está sujeto a variación.
• * Composición de bases: mayor contenido de G-C.
• * Optimizar el emparejamiento de bases: la estabilidad del extremo 5' debe ser alta y la del 3' baja para evitar falsa hibridación. Los extremos 3' no deben ser complementarios para evitar la formación de dímeros. Evitar la presencia de 3 G o C cerca del extremo 3'.
• * Tm: rango de 55–70 °C, y las Tm de los primers no deben diferir en más de 2 °C entre sí.
• * Minimizar la posibilidad de estructura secundaria: deben evitarse horquillas y dímeros de primers.