Cinética Enzimática: Estudio de la Actividad de las Fosfatasas

Cinética Enzimática

Catálisis

enzimát, se usa solo el rango de t en el cual la vel se mantiene constante (lineal).

Vo = cant de prod formado o de sustrato consumido (umoles)/tiempo (min).

2 dif tip de ensayos enz:-Cinéticos o continuos: se det la conc de prod en forma continua o a una serie de t muy próximos durante el transcurso de la reacc. Midiendo el valor de la pendiente de la zona lineal se obtiene la vel ini. Ej: Ensayo de fosfatasa alcalina usando p-nitrofenil-fosfato.

De t fijo: Se detiene la reacc desp de un t det y se mide la conc de prod formado. Ej: Ensayo de fosfatasa alcalina.

Vel ini refleja la activ enzim, se cuantifica en unidades de act enzim (U): cantidad de enz que cata la transformac de 1 μmol por min de sustrato a prod en cond estándar.

Act n° 1 Fosfatasas son enz que cata la hidrólisis del enlace de un grup fosfato unido a un comp orgán. Fosfatasas alcalinas se encuentran localizen el hígado, placenta, huesos e intestino. Nombre de esta enz se debe a que presenta un máx de activ a pH alcalino.

Sustr artificiales son de uso común en ensayos de activ de proteasas, óxido-reductasas, esterasas, lipasas, etc. Los sustr artif facilitan la det por existir una dif considerable entre sus propied espectroscópicas y las del producto correspond, se refleja en un cambio de absorbancia o de emisión (fluorescencia) durante la reacc. Para poder usar un sustr artif se req que la enz lo acepte como sustr.

La hidrólisis del p-nitrofenil-fosfato genera p-nitrofenol, el cual existe como anión en soluc alcalina. El anión p-nitrofenolato presenta una banda de absorc cuyo máx se encuentra a 400 nm, que le confiere un color amarillo, mientras que p-nitrofenil-fosfato no tiene esta banda y en solución es prácticam incoloro. Para la det de activ enz se usa la long de onda de 405 nm, debido a que el sustr absorbe un poco a 400 nm.

Curva de saturación

Mantener const la conc de enz, el pH, la temp, el t de incubación, así como conc de cofact o de activadores (2 últimos comp no siempre se req).

V = Vmax S / Km + S.

-Curva de saturación permite una estimación de KM (conc de sustr a la cual se logra la mitad de la vmáx) y Vmax. Det gráfica de los valores exactos mediante el gráf de los 2bles recíprocos (x 1/V, y 1/S)

-Intersecc de la recta con la ordenada y, corresponde a 1/Vmáx, mientras que la intersección de la recta con la abscisa x, corresponde a -1/KM.