Citometría de Flujo: Fundamentos, Componentes y Aplicaciones Esenciales

La citometría de flujo es una técnica avanzada para el estudio y caracterización de poblaciones celulares en suspensión. Su principal aplicación radica en la identificación y cuantificación de subpoblaciones de linfocitos, especialmente los linfocitos B, ofreciendo un alto poder resolutivo.

Esta metodología permite analizar grandes cantidades de células de un modo multiparamétrico, facilitando la realización de estudios funcionales con diversas poblaciones celulares. Su principal requisito es la necesidad de trabajar con células en suspensión.

La técnica consiste en forzar una suspensión de células, incluidas en un líquido isotónico, a pasar alineadas y de una en una por delante de detectores. Estos detectores miden sus características mientras son iluminadas por un haz de luz láser. De esta interacción, se obtienen dos grupos de parámetros:

• Parámetros de dispersión de luz: Derivados de la luz que se dispersa al incidir sobre la célula.
• Parámetros de fluorescencia: Derivados de la luz generada como consecuencia de la presencia de fluorocromos sobre las células.

El aspecto más importante de la citometría de flujo es que las mediciones se realizan sobre cada célula o partícula de forma individual, y no sobre un promedio de la población, ya que las células pasan una a una a través de un punto específico.

Preparación de Suspensiones Celulares para Citometría

Las suspensiones celulares que se van a utilizar en citometría de flujo deben cumplir una serie de requisitos fundamentales:

• Ser representativas del tejido que se va a estudiar.
• Ser de alta calidad, con pocos agregados y restos celulares.
• Preservar las características celulares intactas.
• Contener suficiente muestra celular para el análisis.

Estas suspensiones pueden prepararse a partir de la disgregación de material fresco. Cuando el tejido es sólido, se emplean métodos mecánicos o enzimáticos, basados en el uso de tripsina, proteasas, colagenasas o mezclas de estas. Es importante destacar que todos estos procedimientos tienen limitaciones, ya que pueden producir alteraciones en las células. Si se pretende analizar antígenos de superficie, es crucial emplear métodos que no los destruyan.

Componentes Clave del Citómetro de Flujo

Un citómetro de flujo se compone de varios sistemas interconectados que permiten el análisis celular:

1. Sistema Hidráulico

   Este sistema conduce la suspensión celular a una velocidad constante y controlada a través de la cámara de flujo, donde las células se exponen una a una al haz iluminador. Está formado por un capilar a través del cual pasa un líquido isotónico, con una velocidad y presión constantes para conseguir la formación de un flujo laminar.

2. Sistema de Iluminación

   Proporciona el haz de luz, normalmente un láser, que ilumina la muestra celular.

3. Sistema Óptico

   Este sistema enfoca la iluminación, detecta la luz que dispersa y selecciona la fluorescencia emitida. Recoge la fluorescencia, donde la señal de luz a 90º está relacionada con la estructura celular, mientras que la señal frontal de la luz se relaciona con el tamaño celular.

4. Sistema Electrónico

   Proporciona una luz de intensidad constante, detectando y amplificando la respuesta de las células para su posterior procesamiento.

5. Sistema de Análisis de Datos

   Procesa la información estadística obtenida y la representa visualmente, comúnmente en forma de histogramas o diagramas de dispersión.

Calibración y Mantenimiento del Citómetro de Flujo

Para asegurar la precisión y fiabilidad de los resultados, la calibración y el mantenimiento preventivo son esenciales:

1. Calibración del Láser

   Esta calibración se realiza mediante estándares o patrones con valores determinados de fluorescencia. Proporciona un nivel o línea base para la detección de fluorescencia. El control de calidad diario utiliza controles positivos y negativos conocidos para comprobar el correcto funcionamiento de la técnica. Es necesario un mantenimiento preventivo del citómetro, siguiendo una serie de pasos recomendados antes de comenzar las determinaciones y después de cada ronda.

2. Mantenimiento Preventivo del Citómetro

   El citómetro de flujo no se puede utilizar sin un entrenamiento previo adecuado. Es necesario que exista un responsable del equipo. También se deben realizar las verificaciones y controles establecidos.

   Pasos Antes de Comenzar las Determinaciones:

   1. Encender, en este orden, el láser, la bomba de la solución de flujo y el ordenador.
   2. Esperar 30 segundos para que el equipo se estabilice.
   3. Purgar el equipo, comprobando que no hay burbujas en el circuito.
   4. Comenzar a trabajar.

   Pasos al Finalizar la Ronda de Determinaciones:

   1. Se deben hacer pasar unos mililitros de solución de lavado durante al menos 5 minutos.
   2. Se apagan, en este orden, la bomba de la solución de flujo, el ordenador y, finalmente, el láser.

Determinación de Poblaciones Celulares en Sangre Periférica

Para la identificación y clasificación de las células, tanto normales como patológicas, se emplea la determinación de antígenos intracelulares mediante citometría de flujo. Esta aplicación es fundamental en el diagnóstico y monitorización de diversas enfermedades linfocitarias.