Clonación de ADN y Técnicas de Ingeniería Genética

Clonación de ADN: Proceso que hace múltiples copias idénticas de un fragmento particular de ADN.

Proceso de Clonación

• Obtención del ADN de interés
• Ligación - unión a vector
• Propagación

RT-PCR (retrotranscriptasa)

Transcripción inversa (RT): El ARN se convierte en ADN complementario (ADNc) utilizando la enzima transcriptasa inversa.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): El ADNc se amplifica para producir múltiples copias de un segmento específico de ADN, facilitando su detección y análisis.

La clonación a partir de ARN mensajero (ARNm): Es una técnica de biología molecular que convierte el ARNm en ADN complementario (ADNc) usando la enzima transcriptasa inversa. Este ADNc se inserta en un vector de clonación, que se introduce en células hospedadoras para su replicación y análisis.

Pasos clave en la clonación a partir de ARNm:

1. Extraer ARNm de las células.
2. Convertir el ARNm en ADNc utilizando transcriptasa inversa.
3. Ligar el ADNc a un vector de clonación.
4. Transformar células hospedadoras con el vector recombinante.
5. Seleccionar y analizar los clones que contienen el ADNc.

Enlazadores (Linkers) en cortes romos: Los enlazadores son secuencias de ADN diseñadas específicamente para conectarse con extremos de ADN cortados de manera "romo" o sin extremos sobresalientes. Estos enlazadores facilitan la unión de fragmentos de ADN durante la construcción de moléculas recombinantes en biología molecular. Son útiles en técnicas como la clonación molecular.

Adaptadores para cortes romos: Los adaptadores para cortes romos son secuencias de ADN diseñadas para unir extremos de ADN cortados de manera "romo". Estos adaptadores permiten la unión eficiente de fragmentos de ADN con extremos sin sobresalientes, facilitando técnicas como la clonación y la generación de librerías de ADN.

Extremos homoploméricos: Los extremos homoploméricos son extremos de ADN que consisten en repeticiones de la misma base nitrogenada, como adenina (A), citosina (C), guanina (G) o timina (T), en una secuencia continua. Estos extremos pueden formarse durante la amplificación de ADN mediante técnicas como la PCR y pueden afectar la eficiencia de ciertos procesos moleculares, como la clonación o la secuenciación de ADN.

Células huéspedes con ADN recombinante: Son células que han sido modificadas para contener ADN recombinante, es decir, ADN que ha sido introducido artificialmente en su genoma. Estas células se utilizan en biotecnología y biología molecular para producir proteínas recombinantes, estudiar la función de genes específicos, desarrollar terapias génicas, entre otros fines.

Vectores: Plásmidos, una molécula pequeña de ADN circular que se encuentra en las bacterias y algunos otros organismos microscópicos.

Características de un plásmido en la Ingeniería Genética

• Origen de replicación
• Tamaño pequeño
• Genes de selección
• Múltiples sitios de restricción

Bacteriófagos: Virus que mutan bacterias por la Ingeniería Genética. Fueron usados por primera vez para tratar a una paciente que lucha contra una persistente y peligrosa infección superbacteriana.

Ciclo de Reproducción Viral

Ciclo lítico: El virus infecta la célula, se replica y finalmente provoca su ruptura para liberar nuevas partículas virales.

Ciclo lisogénico: El ADN viral se integra en el genoma de la célula huésped y permanece inactivo por un tiempo, replicándose junto con el ADN celular.

Genoma de un fago lambda e inserción del gen de interés: El fago lambda es un virus que infecta bacterias y su genoma consiste en ADN de doble cadena. La inserción de un gen de interés en el fago lambda implica la introducción de un segmento específico del ADN del fago en el genoma de la célula huésped.

Cómo se Introduce el ADN en las Células

Transformación genética: Es el proceso artificial de introducir ADN en una célula, utilizando métodos como la electroporación, microinyección o vectores virales, con el fin de modificar su composición genética.

Experimento de Frederick Griffith: El Experimento de Frederick Griffith demostró en 1928 que las bacterias pueden transferir material genético entre sí. Observó que al inyectar ratones con una bacteria muerta y luego con una bacteria viva diferente, la bacteria viva adoptaba las características de la muerta. Este hallazgo sugirió la existencia de un proceso de transformación genética, sentando las bases para la genética molecular.

Células competentes: Son células que han sido tratadas para permitir la entrada de ácidos nucleicos exógenos. Este proceso generalmente involucra el tratamiento de células con soluciones de calcio o la exposición a campos eléctricos pulsados (electroporación), lo que temporalmente aumenta la permeabilidad de la membrana celular y facilita la toma de ADN.

Células quimioptentes: Son células que han sido modificadas o tratadas con compuestos químicos para aumentar temporalmente su permeabilidad, permitiendo así la entrada de ácidos nucleicos exógenos en ausencia de métodos físicos como la electroporación.

Transformación por electroporación: Un método de introducción de ADN exógeno en células que implica la aplicación de breves pulsos eléctricos a una mezcla de células y ADN, lo que provoca la formación de poros temporales en la membrana celular, a través de los cuales el ADN puede entrar en la célula.

Proceso de transformación: Se refiere al conjunto de pasos y técnicas utilizadas para introducir material genético exógeno en células vivas. Este proceso puede incluir la preparación de células competentes, la adición de ADN exógeno, la incubación y la selección de células transformadas.

Biobalística: También conocida como "bombardeo de genes", es una técnica que utiliza microproyectiles de metal recubiertos con ADN u otros materiales genéticos para introducir genes en células mediante la aplicación de una presión de gas o un impulso eléctrico.

Micropropagación: Una técnica de cultivo in vitro que permite la propagación rápida de plantas a partir de tejidos vegetales, como yemas o segmentos de tallo, utilizando medios de cultivo y condiciones controladas de luz y temperatura.

Microinyección: Una técnica de transferencia de genes que implica la inyección directa de material genético en el núcleo de una célula utilizando una microaguja extremadamente fina, lo que permite la introducción precisa de material genético en células individuales.

Selección y escrutinio: La fase del proceso de transformación en la que se identifican y seleccionan las células que han tomado el material genético exógeno con éxito, seguido de un análisis detallado para verificar la presencia y la estabilidad del gen insertado.

Inactivación insercional: Una técnica utilizada para interrumpir la función de un gen específico mediante la inserción controlada de material genético exógeno, como un gen de resistencia a antibióticos, en la secuencia del gen de interés, lo que puede permitir el estudio de la función del gen al observar los efectos de su inactivación.

Secuenciación de ADN: Es una tecnología que permite conocer y descifrar el código genético que tienen todos los seres vivos.

Secuenciación de Sanger

Pasos clave en la secuenciación de Sanger:

1. Se divide la muestra de ADN en cuatro tubos de reacción separados.
2. En cada tubo, se agrega una mezcla de desoxirribonucleótidos (dNTPs) y un dideoxinucleótido (ddNTP) específico, además de ADN polimerasa y un nucleótido fluorescente.
3. La ADN polimerasa comienza a sintetizar una nueva cadena de ADN utilizando el ADN molde presente en el tubo de reacción y los nucleótidos disponibles.
4. Cuando un ddNTP se incorpora en la cadena en crecimiento, la síntesis se detiene, generando fragmentos de ADN de diferentes longitudes.
5. Los fragmentos de ADN se separan mediante electroforesis en geles de poliacrilamida.
6. Se detecta la fluorescencia de los fragmentos de ADN para determinar la secuencia de nucleótidos.

Pirosecuenciación

Pasos clave en la pirosecuenciación:

• La muestra de ADN se fragmenta y se une a una superficie sólida.
• Se inicia la amplificación de cada fragmento utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
• Se presenta uno de los cuatro nucleótidos en cada ciclo de extensión de la cadena de ADN.
• Si el nucleótido se incorpora en la cadena, se libera pirofosfato (PPi).
• La enzima luciferasa convierte el PPi en luz, que se mide para determinar qué nucleótido se incorporó en ese ciclo.
• Este proceso se repite múltiples veces para cada fragmento de ADN, permitiendo la determinación de la secuencia de nucleótidos.

Genotecas de ADN: Son colecciones de fragmentos de ADN que representan el genoma completo o parte del genoma de un organismo. Estos fragmentos están insertados en vectores, como plásmidos o bacteriófagos, y se utilizan para estudiar la organización y la función de los genes.

Clasificación de Genotecas según la Naturaleza del ADN

• ADN genómico: Genoteca que contiene fragmentos de ADN extraídos directamente del genoma de un organismo.
• De cDNA: Genoteca que contiene fragmentos de ADN complementario (cDNA) generados a partir de ARN mensajero (ARNm) mediante la acción de la enzima transcriptasa inversa.

Aplicaciones de las Genotecas

• Identificación y clonación de genes de interés.
• Estudio de la estructura y organización del genoma.
• Investigación de la expresión génica y análisis de transcriptomas.
• Generación de sondas y cebadores para técnicas de hibridación y PCR.
• Construcción de bibliotecas genómicas para secuenciación y análisis funcional de genes.

Mutagénesis: Proceso mediante el cual se induce la aparición de mutaciones en el ADN, que son cambios en la secuencia de nucleótidos. Las mutaciones pueden ser causadas por agentes físicos, químicos o biológicos y pueden tener diferentes efectos en los organismos, desde nulos hasta letales o beneficiosos.

Mutagénesis dirigida por oligonucleótidos: Es un método que implica el diseño y la síntesis de oligonucleótidos complementarios a la secuencia de ADN objetivo, pero con una mutación específica introducida en el oligonucleótido. Este oligonucleótido mutante se utiliza para reemplazar la secuencia específica en el genoma, induciendo así una mutación controlada en un gen específico.

Mutagénesis aleatoria por PCR: Es una técnica que utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para generar mutaciones aleatorias en una secuencia de ADN específica. Durante la amplificación de la secuencia de interés, se introducen errores aleatorios en la copia de ADN mediante la inclusión de nucleótidos incorrectos o mutagénicos en la mezcla de PCR.

Mutagénesis aleatoria química: Implica el tratamiento del ADN con agentes químicos mutagénicos, como nitrosaminas o alquilantes, que pueden inducir cambios aleatorios en la secuencia de ADN. Estos agentes químicos pueden modificar las bases de nucleótidos, causando la introducción de mutaciones puntuales o incluso la inserción o eliminación de nucleótidos.

Mutagénesis insercional: Es un proceso mediante el cual se inserta un fragmento de ADN extraño, como un transposón o un vector de mutagénesis, en el genoma de un organismo. Esta inserción puede causar una interrupción en el genoma, lo que resulta en la inactivación o alteración de la función de los genes cercanos.

Transposones: Son secuencias de ADN móviles que pueden moverse de un lugar a otro dentro del genoma de un organismo. Los transposones pueden causar mutaciones insercionales cuando se insertan en genes funcionales, lo que puede tener efectos diversos en el organismo, desde la inactivación de genes hasta la generación de variabilidad genética.

Mutación por nucleasas de dedos de zinc: Es una técnica de ingeniería genética que implica la modificación específica de la secuencia de ADN utilizando nucleasas de dedos de zinc diseñadas para reconocer y cortar secuencias específicas de ADN. Estas nucleasas pueden inducir mutaciones puntuales, inserciones o delecciones en el ADN, lo que permite la introducción controlada de cambios en el genoma.

Nucleasas por dedos de zinc (ZFNs): Son herramientas que cortan el ADN en lugares específicos. Funcionan como tijeras de precisión que pueden cortar el ADN en una ubicación exacta. Se usan en ingeniería genética para hacer cambios específicos en el ADN.

Endonucleasa FokI: Es una enzima que corta el ADN en dos partes. Requiere unirse a otra copia de sí misma (formando un dúo) para hacer el corte. Se usa en combinación con las ZFNs para dirigir y realizar cortes precisos en el ADN.

CRISPR/Cas: Es como un sistema inmunológico de bacterias. Utiliza una "guía" de ARN para encontrar y cortar el ADN en lugares específicos. Este sistema se ha adaptado como una herramienta poderosa para hacer cambios en el ADN de cualquier organismo.

Edición genética CRISPR/Cas: Es el uso de la tecnología CRISPR/Cas para hacer cambios precisos en el ADN de células y organismos. Con esta herramienta, los científicos pueden cortar, pegar o modificar secciones específicas del ADN, abriendo puertas a nuevas posibilidades en la investigación y la medicina.