Clonación Molecular: Proceso, Componentes y Métodos de Selección de ADN Recombinante

Introducción a la Clonación Molecular

La clonación molecular es un proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN genómico o de ADNc, basado en la tecnología de ADN recombinante. Este método permite obtener múltiples copias idénticas de un fragmento de ADN de interés.

Componentes Esenciales para la Clonación

Para llevar a cabo la clonación molecular, se requieren dos componentes principales:

• Vector de Clonación: Son moléculas de ADN que tienen la capacidad de replicarse autónomamente en una célula huésped. Permiten la inserción de ADN extraño sin perder su capacidad de replicación.
• Célula Hospedadora: Son las células en las que se introduce el vector de clonación para su amplificación mediante replicación.

Vector de Clonación

Características de un Vector de Clonación

Un vector de clonación ideal debe poseer las siguientes características:

• Origen de Replicación (ori): Permite que el vector se replique de forma independiente dentro de la célula huésped.
• Sitio de Inserción de ADN Extraño (Polylinker o MCS): Una región que contiene múltiples sitios de restricción únicos, facilitando la inserción del fragmento de ADN a clonar.
• Marcador de Selección: Un gen que confiere una característica detectable (ej. resistencia a un antibiótico) que permite distinguir las células que han captado el vector de las que no lo han hecho.
• Marcador de Identificación: Un gen que permite identificar las células que portan un vector recombinante (con el inserto) de aquellas que portan un vector no recombinante (sin el inserto).

Tipos de Vectores de Clonación

Existen diversos tipos de vectores, cada uno con aplicaciones específicas:

• Plásmidos: Moléculas circulares de ADN bicatenario extracromosómico de origen bacteriano, con capacidad autónoma de replicación. Son los más comunes.
• Bacteriófagos: Virus que infectan bacterias, utilizados para clonar fragmentos de ADN más grandes.
• Cósmidos: Híbridos entre plásmidos y fagos, combinando características de ambos.
• Fagémidos: Plásmidos que contienen un origen de replicación de fago, permitiendo la producción de ADN monocatenario.
• Cromosomas Artificiales: Como los YAC (Yeast Artificial Chromosomes) o BAC (Bacterial Artificial Chromosomes), capaces de clonar fragmentos de ADN muy grandes.

Célula Hospedadora

Tipos de Células Hospedadoras

Las células hospedadoras se clasifican principalmente en:

• Células Hospedadoras Bacterianas (Procariotas):
  • Carecen de exonucleasas para evitar la degradación de vectores de clonación lineales.
  • La bacteria más utilizada en clonación es Escherichia coli (E. coli), especialmente la cepa K12.
• Células Hospedadoras Eucariotas:
  • Incluyen levaduras, células vegetales y células animales (de insectos o mamíferos).
  • Se utilizan para la expresión de proteínas eucariotas o para clonar genes con intrones.

Fases del Proceso de Clonación Molecular

El proceso de clonación molecular se divide en tres fases principales:

1. Creación del vector recombinante.
2. Introducción del vector recombinante en la célula hospedadora.
3. Selección e identificación de los clones que portan la secuencia de interés.

1. Creación del Vector Recombinante

Un vector recombinante es aquel que contiene un inserto de ADN extraño (el ADN que se desea clonar). El ADN a clonar y el vector de clonación se unen mediante la acción de una enzima ligasa.

Preparación del ADN a Clonar

El ADN que se va a clonar debe ser tratado con una enzima de restricción (endonucleasa) que genere extremos compatibles con el vector. Estas enzimas cortan el ADN en secuencias específicas.

Preparación del Vector de Clonación

El vector de clonación se digiere con la misma enzima de restricción que se utilizó para preparar el ADN a clonar. Esto asegura que ambos fragmentos tengan extremos complementarios.

Inserción del ADN Extraño en el Vector (Ligación)

La inserción se realiza mezclando el ADN a clonar y el vector de clonación en las concentraciones adecuadas. La enzima ADN ligasa sella covalentemente las mellas en la doble hélice de ADN, produciendo así el vector recombinante.

2. Introducción del Vector en la Célula Hospedadora

La forma de introducir el vector recombinante en la célula hospedadora depende del tipo de vector y de la célula. Los métodos más comunes son:

Transformación Bacteriana

Consiste en la captación e internalización por parte de una bacteria de moléculas de ADN desnudas presentes en el medio externo. Las bacterias deben ser competentes (capaces de captar ADN).

Transfección

Es un proceso similar a la transformación, pero se aplica a células hospedadoras eucariotas (especialmente en animales). Se define como la introducción de vectores recombinantes en células eucariotas no mediada por virus.

Transducción

Consiste en la introducción de material genético extraño en una célula mediante la acción de un virus (ej. bacteriófagos para bacterias, o lentivirus para células eucariotas).

Electroporación

Consiste en aplicar cortos pulsos eléctricos de alto voltaje a una mezcla de células hospedadoras en suspensión y vectores recombinantes en solución. Estos pulsos crean poros temporales en la membrana celular, permitiendo la entrada del ADN.

3. Selección e Identificación de Clones Recombinantes

Después de la introducción del vector, se obtienen tres tipos celulares principales:

• Células no transformadas: No han captado ninguna molécula de ADN extraño.
• Células transformadas que portan el vector no recombinante: Han captado el vector de clonación, pero este no contiene el inserto de ADN extraño.
• Células transformadas que portan el vector recombinante: Han captado el vector de clonación con el inserto de ADN de interés.

Marcadores de Selección

Los marcadores de selección permiten distinguir las células transformadas de las no transformadas. Un ejemplo común es la resistencia a antibióticos:

• Célula no transformada: Sensible a ampicilina y tetraciclina; no crece en medios con estos antibióticos.
• Célula transformada sin inserto (vector no recombinante): Resistente a ampicilina y tetraciclina (si el vector contiene ambos genes de resistencia); crece en medios con estos antibióticos.
• Célula transformada con inserto (vector recombinante): Resistente a ampicilina y sensible a tetraciclina (si el inserto interrumpe el gen de resistencia a tetraciclina); no crece en medios con tetraciclina, pero sí en ampicilina.

Estrategias de Identificación

Una vez seleccionadas las células transformadas, se necesita identificar cuáles de ellas portan el vector recombinante con el inserto deseado.

Estrategia Cromogénica (LacZα)

Esta estrategia se basa en la inactivación insercional del gen LacZα, que codifica para la subunidad α de la β-galactosidasa. Se utiliza con bacterias hospedadoras que son lactosa negativas y sensibles a antibióticos, y que no producen la β-galactosidasa.

• Vector: Contiene un gen de resistencia a un antibiótico y el gen LacZα con un polylinker en su interior.
• Cultivo: Las bacterias se cultivan en un medio que contiene el antibiótico, IPTG (inductor de LacZα) y X-Gal (sustrato cromogénico de la β-galactosidasa).
  • Colonia azul: Indica un vector sin inserto (no recombinante), ya que LacZα está funcional y produce β-galactosidasa, que metaboliza X-Gal a un producto azul.
  • Colonia blanca: Indica un vector recombinante, ya que el inserto ha inactivado LacZα, impidiendo la producción de β-galactosidasa y, por lo tanto, la formación del color azul.

Proteínas Fluorescentes (GFP)

Similar a la estrategia cromogénica, pero utilizando un gen que codifica para una proteína fluorescente, como la Proteína Fluorescente Verde (GFP).

• Vectores: Contienen un gen de resistencia a un antibiótico y un gen de proteína fluorescente (ej. GFP). El polylinker se encuentra dentro del gen de la GFP.
• Identificación:
  • Fluorescencia verde: Indica un vector sin inserto (no recombinante), ya que el gen de la GFP está funcional.
  • No fluorescencia: Indica un vector recombinante, ya que el inserto ha inactivado el gen de la GFP.

Genes Letales

Esta estrategia utiliza un gen que codifica para una proteína letal para las bacterias, con el polylinker en su interior.

• Vectores: Contienen un gen de resistencia a un antibiótico y un gen que codifica para una proteína letal para las bacterias, con el polylinker en su interior.
• Selección e Identificación: Se realiza cultivando las bacterias en un medio con el antibiótico en cuestión.
  • Las bacterias con un vector sin inserto (no recombinante) producirán la proteína letal y morirán.
  • Las bacterias con un vector recombinante (con el inserto) tendrán el gen letal inactivado, sobrevivirán y crecerán.