Clonación y ADN recombinante: fases y procedimientos

Fases del Procedimiento de Clonación

1. Construcción del ADN Recombinante

   Se cortan, mediante enzimas de restricción, el ADN exógeno y el vector, generando bordes cohesivos complementarios. Luego, se une el primero al segundo gracias a la acción de una ADN ligasa.

2. Transferencia del ADN a la Célula Huésped

   Existen diversas formas de introducir el ADN en la célula huésped:

   • Infección por virus y fagos: Se inserta el ADN exógeno en virus o fagos para que lo introduzcan en la célula huésped.
   • Transformación por choque térmico: Se tratan las células con iones metálicos, alterando la permeabilidad de su membrana celular. Al aumentar la temperatura, el ADN exógeno puede entrar.
   • Electroporación: Se altera la permeabilidad de la membrana celular mediante descargas eléctricas.
   • Transfección con fosfato cálcico: El ADN forma un precipitado en un medio con fosfato cálcico y se introduce en la célula huésped.
   • Lipofección: Se introduce el ADN exógeno en la célula huésped gracias a liposomas que se fusionan con su membrana celular.
   • Microinyección: El ADN exógeno se introduce en la célula huésped mediante microscopía y microjeringas.

3. Selección de las Células Huésped

   Se seleccionan aquellas células en las que el vector se ha introducido correctamente, identificadas por la expresión de genes propios del vector.

4. Construcción de una Biblioteca de ADN o Genoteca

   Es una colección de los diferentes clones realizados en el laboratorio. Hay dos tipos:

   • Genoteca genómica: Incluye muestras de todos los genes de un organismo.
   • Genoteca de expresión: Incluye todos los ADNc obtenidos a partir de ARNm de un tipo celular en particular.

Tecnología del ADN Recombinante

El ADN recombinante resulta de la unión del ADN de dos organismos distintos. Como esto no ocurre de forma natural, se manipulan ambas muestras de ADN para unirlas:

1. Escisión del ADN que se quiere clonar mediante la acción de endonucleasas que ofrezcan el ADN en fragmentos concretos, preferiblemente con bordes cohesivos, que son más fáciles de unir a otras moléculas de ADN por complementariedad de bases.
2. El vector al que se unirá el ADN exógeno también se trata con estas enzimas, quedando un hueco donde el ADN exógeno encaje.
3. La unión entre ambos es llevada a cabo por una ADN ligasa, que une los fragmentos y forma el ADN recombinante.

Posteriormente, este ADN recombinante se introduce en la célula mediante diversas técnicas.