Clonación y Transferencia Génica: Vectores y Técnicas Esenciales
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Vectores de Clonación Genética
Bacteriófago
El bacteriófago es un vector de clonación cuyo proceso es similar al del plásmido. Se extrae ADN de la preparación del fago lambda y se le corta el gen central con una enzima de restricción. El ADN a clonar, junto con el cromosoma recombinante, se corta con la misma enzima de restricción y se adhiere en el espacio del gen central, creando así un virus recombinante. Este podrá infectar células bacterianas, replicando su ADN y, por lo tanto, el cromosoma.
Cósmido
El cósmido está formado por el cuerpo del fago lambda, que contiene ADN y secuencias plasmídicas de replicación, así como genes de resistencia a antibióticos. Una vez que el cósmido (con su cuerpo de fago) se introduce en una célula huésped, se replica como un plásmido. Los cósmidos pueden contener hasta 50 kb de ADN, mientras que los fagos suelen albergar hasta 15 kb y los plásmidos hasta 5 kb.
Técnicas de Transformación Genética
Transformación en Bacterias
Choque Térmico
Para la transformación por choque térmico, las bacterias se hacen competentes utilizando una solución de CaCl2 a 0 ºC durante 10 minutos, lo que ayuda a desimpermeabilizar la membrana celular. Posteriormente, se introduce el ADN para que se adhiera a las paredes bacterianas. Se aplica un choque térmico a 42 ºC, lo que favorece la incorporación del ADN. Finalmente, se vuelven a colocar en hielo durante 2 minutos y se incuban a 37 ºC durante 1 hora antes de ser sembradas.
Electroporación
La electroporación implica la administración de pulsos eléctricos a las células para introducir un gen deseado. Las células (o bacterias) y el ADN se introducen en una cubeta con una solución conductora, donde se encuentran dos electrodos opuestos. Los choques eléctricos crean poros temporales en las membranas o paredes celulares, permitiendo que el ADN se introduzca a través de estos poros.
Transfección (mediada por Bacteriófagos)
La transfección, en el contexto de la transformación bacteriana, puede referirse a la introducción de ADN en células bacterianas mediante el uso de bacteriófagos como vectores. Este proceso es una forma de transferencia génica mediada por virus.
Transformación en Levaduras
Método de Acetato de Litio
El método de acetato de litio para levaduras es una técnica de choque térmico modificada. En este caso, las células de levadura se hacen competentes utilizando una combinación de acetato de litio y PEG (Polietilenglicol) para facilitar la captación de ADN.
Transformación en Plantas
Biolística (Cañón de Genes)
La biolística, también conocida como bombardeo de partículas o cañón de genes, implica cubrir micropartículas (generalmente de oro o tungsteno) con el ADN que contiene el gen de interés. Estas micropartículas se disparan con gran fuerza y velocidad hacia las células (comúnmente vegetales), atravesando sus paredes celulares e introduciendo el ADN en su interior.
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens es una bacteria fitopatógena que contiene un plásmido Ti (inductor de tumores), el cual posee una región conocida como T-DNA. Este plásmido se extrae de la bacteria y se corta con una enzima de restricción. El gen deseado se inserta en el plásmido Ti modificado, que luego se reintroduce en la bacteria. Posteriormente, Agrobacterium infecta una célula vegetal, transfiriendo el T-DNA (ahora con el gen de interés) al genoma de la planta. La célula vegetal se reproducirá y formará una nueva planta que contendrá el gen deseado.
Vectores Virales para Células Animales e Insectos
Retrovirus y Adenovirus
Los retrovirus y adenovirus son vectores virales ampliamente utilizados para la transferencia génica en células animales. Se modifican para eliminar su capacidad patógena y se utilizan para introducir ADN exógeno en el genoma de las células huésped.
Baculovirus
Los baculovirus son vectores virales específicos para la expresión de proteínas y la transferencia génica en células de insectos. Son especialmente útiles para la producción a gran escala de proteínas recombinantes.