Clonación y vectores en ADN recombinante

La clonación: proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN genómico o de ADNc basada en la tecnología de ADN recombinante (crear moléculas de ADNre que serán introducidas en una célula huésped por multiplicación de estas células en cultivo se consiguen copias del ADNre y del fragmento amplificado de interés.

Los vectores

Los vectores: moléculas de ADN que pueden replicarse autónomamente en una célula huésped y que permiten la inserción de ADN extraño, sin perder esa capacidad de replicación autónoma. Tener un origen de replicación (permite replicarse en la célula huésped junto con el fragmento de ADN extraño), tener un sitio de inserción (secuencias diana de enzimas de restricción - polylinker: todas las dianas se concentran en un segmento corto del vector), contener algún marcador de selección (permita distinguir las células que portan el vector de aquellas que no), contener un marcador de identificación (permita distinguir las células que portan un vector recombinante, con ADN extraño, de aquellas que portan un vector sin).

Los plásmidos

Los plásmidos: moléculas circulantes de ADN bicatenario extracromosómico de origen bacteriano con capacidad autónoma de replicación - el tamaño del inserto que puede transportar, el número de copias del plásmido por célula que puede alcanzar tras su replicación en la célula hospedadora; ppBR322 (transporta fragmentos de ADN y el número de copias es de 20), pUC18 (insertos hasta 10kb y su alta tasa de replicación).

Los bacteriófagos

Los bacteriófagos (M13: insertos hasta 20kb) son virus que infectan bacterias: su utilización como vector implica la sustitución de la región central por ADN extraño. Ciclo lítico: el virus se une a la célula hospedadora de forma estable, el ADN viral entra en la célula mediante una perforación en la pared bacteriana, se produce una síntesis de ARN y finalmente los viriones salen de la célula. Ciclo lisogénico: el virus se pega a la pared de la bacteria e introduce su ADN se combina con el ADN bacteriano y permanece inactivo hasta que haya un cambio en el medio celular, ya que se libera el profago (virus activo) y continuará con el ciclo lítico.

FAGO LAMBDA

FAGO LAMBDA (se purifica el ADN del fago y se corta con un enzima de restricción, con el mismo enzima de restricción se corta el fragmento de ADN de interés y se unen con una DNA ligasa. Los vectores lambda recombinantes se empaquetan in vitro en las cápsides proteicas del fago, y se introducen en células huésped bacterianas. Dentro de los bacterias, los vectores se replican y forman muchas copias del fago infectivo, portando todas ellas el fragmento de ADN de interés en la clonación. Los vectores fágicos pueden transportar fragmentos de hasta 20 kb (kilobases).

Cosmidis (pJB8: 50kb)

Cosmidis (pJB8: 50kb): vectores híbridos construidos con parte del cromosoma del fago lambda y parte de un plásmido bacteriano (cos fago + origen de replicación + plásmido + gen resistencia antibióticos y polylinker).

Fagémidos

Fagémidos: vectores híbridos compuestos por un plásmido al que se le inserta el origen de replicación de un fago M13 (manteniendo todas las utilidades de los plásmidos con capacidad de producir ADN mono).

Cromosomes artificials

Cromosomes artificiales: vectores de alta capacidad de clonación con capacidad de transportar fragmentos de ADN de gran tamaño - BAC (insertos 300kb), YAC (1Mb).

Vectores lanzadera

Vectores lanzadera: vectores híbridos que contienen orígenes de replicación de dos hospedadores diferentes (plásmido bacteriano y levadura/virus animal (SV40).

Células hospedadoras

Células hospedadoras: se introduce el vector de clonación para su amplificación mediante replicación. Bacterianas (E.coli): más utilizadas, fácil manipulación, soques defectivas, alta tasa de replicación. Eucariotas: levaduras (S.cerevisiae), vegetales (plásmidos Agrobacterium tumefaciens), animal (vectores víricos - retrovirus mamíferos).

Fases

Fases - 1: creación de un vector recombinante (inserto de ADN extraño, ADN que se va a clonar y el vector y unirse por una ligasa (crear extremos cohesivos y complementarios en los extremos). Preparación del ADN que se va a clonar. Vector de preparación (digerirlo con la misma enzima de restricción que se utilizó en la preparación): vector circular, con diana de restricción única (molécula lineal con extremos cohesivos - plásmidos); vector circular con dos dianas de restricción (dos moléculas lineales con extremos cohesivos: grande (marcadores genéticos de selección e identificación) y pequeño (sustituido por ADN extraño); vector lineal con diana de restricción única (dos brazos izquierdo y derecho, cada uno con un extremo romo y un extremo cohesivo); vector lineal con dos dianas de restricción - fago lambda (dos brazos con un extremo romo y cohesivo y una región central (ADN extraño) con ambos extremos cohesivos). Inserción del ADN extraño en el vector: mezclando ADN y vector para que las dos moléculas se unan a través de los extremos cohesivos generados a partir ADN ligasa y finalmente seleccionar las células hospedadoras.

2: introducción del vector en la célula hospedadora. Transformación bacteriana (captación e internalización por parte de una bacteria de moléculas de ADN desnudas presentes en el medio externo - competentes: tratamiento químico (cloruro sódico) y físico (choque térmico) permeabilidad pared y membrana, facilita vector recombinante al interior de las bacterias y siembra). Transfección (animales - introducción de vectores recombinantes en células eucariotas no mediada por virus basados en la utilización de agentes químicos. Vector con fosfato cálcico sobre un cultivo, el vector coprecipita sobre las membranas y es introducido dentro por endocitosis. Incluir el vector en el interior de liposomas, se fusionan con las membranas y liberan su contenido al interior de la célula). Transducción (introducción de material genético extraño en una célula por acción de un virus - el vector recombinante se empaqueta dentro de la cápside de un virus con el que se infecta un cultivo). Electroporación (consiste en aplicar cortos pulsos eléctricos de alto voltaje a una mezcla de células hospedadoras en suspensión y vectores recombinantes en solución).

3: selección e identificación de clones recombinantes: Genes de resistencia a antibióticos (ampicilina y tetraciclina - el punto de inserción del ADN extraño se encuentra en el interior de la secuencia de uno de los genes de resistencia de manera que en los vectores recombinantes ese gen no es funcional, ya que su secuencia está interrumpida por el inserto de ADN extraño). Estrategia cromogénica (bacterias hospedadoras defectivas lac- y vectores que contienen un gen de resistencia al antibiótico y el gen LacZa con un polylinker en su interior - selección e identificación a la vez en un medio sólido con el antibiótico (inductor lac y sustrato X-gal), blancas: vector recombinante (lac-), azules: vector no recombinante (lac+). Proteínas fluorescentes (vectores con un gen de resistencia para la selección y un gen que codifica una proteína (GFP) fluor (polylinker) para la identificación - fluor: bacterias transformadas con plásmidos no recombinantes; no fluor: plásmidos recombinantes). Genes letales (gen de resistencia a un antibiótico (selección) y gen que codifica para una proteína letal (identificación) con un polylinker y se cultiva en un medio con el antibiótico).

Bibliotecas de ADN

Bibliotecas de ADN: es una colección de vectores recombinantes clonados cuyas secuencias de ADN extraño se han obtenido de un único organismo. Bibliotecas genómicas (vectores recombinantes clonados que incluyen el genoma completo de un organismo). Bibliotecas cromosómicas (bibliotecas de ADN construidas a partir de un único cromosoma o fracción cromosómica). Biblioteca de ADNc (a partir del ARNm de un tejido o una población celular determinada, previa transcripción inversa con una retrotranscriptasa). Análisis: 1: identificación del clon (técnicas de hibridación). 2: paseo cromosómico (identificación de clones que porten secuencias consecutivas). 3: secuenciación (descifrar la secuencia del ADN).

Aplicaciones

Aplicaciones: fabricación de productos terapéuticos (insulina, hormona del crecimiento, antiHb), terapia génica (tratamiento contra la inmunodeficiencia combinada grave), alimentos resistentes a plagas y herbicidas (trigo resistente al insecto barrenador), alimentos mejorados o más eficientes, control de plagas (mosquitos resistentes a la malaria).