Cromatografía de Hemoglobina A2: Protocolo Detallado

Cromatografía de Hb A2

Materiales

• Prepipeta
• Micropipeta 20 μl
• Soporte de bureta
• 3 tubos de cultivo de vidrio
• 1 tubo de hemólisis
• Papel de filtro
• Gradilla
• Pipeta Pasteur
• Columna de cromatografía
• Micropipeta de 100-1000 μl
• Pipeta graduada 1 ml
• Pipeta graduada 10 ml

Muestra

• Sangre anticoagulada con EDTA

Reactivos

Kit:

• Reactivo 1
• Reactivo 2
• Agua destilada

Técnica

• Poner boca arriba la columna de cromatografía para que se desempaquen.
• Empujar con una pipeta Pasteur de vidrio el disco para que se quede pegado a la retina (sic, probablemente se refiere a la base de la columna).
• Colocar la columna de cromatografía en el soporte de bureta.
• Colocar los tubos de cultivo bajo la columna, de modo que el líquido filtrado caiga en los tubos.
• En el tubo de hemólisis, preparar el hemolizado: poner 1 ml de reactivo 1 y 100 μl de sangre.
• En un tubo de cultivo, preparar el preparado de hemolizado: poner 20 μl del preparado de hemolizado y 10 ml de agua destilada. Se leerá su absorbancia en espectrofotómetro.
• Una vez que la columna de cromatografía ha terminado de filtrar el líquido inicial, poner 100 μl del hemolizado.
• Una vez filtrado el hemolizado, poner 1 ml del reactivo 2 y esperar a que se filtre.
• Poner 10 ml de reactivo 2 y medir (esta es la mezcla que tiene Hb A2).
• Medir la absorbancia del preparado hemolizado. Previamente, poner a cero el espectrofotómetro con agua destilada ("blanco"). Obtener los siguientes resultados:

Longitud de onda                               Absorbancia

S2= 414nm                                                   0,178

S1= 414nm                                  -0,17

• En la columna, cuando el hemolizado ya haya pasado el disco, poner 1 ml del reactivo 2.
• Una vez filtrado el hemolizado y el reactivo 2, desechar y cambiar el tubo.
• Poner un tubo de cultivo nuevo y poner 10 ml de reactivo en la columna de cromatografía y esperar a que se filtre.

Lectura de Resultados

S1 = Absorbancia de Hb A2

S2 = Absorbancia del preparado hemolizante

(S1 / S2) x 20 = % de Hb A2

Nota:

No es medible porque su absorbancia es negativa (-0,17).