Cromatografía: Tipos y Técnicas de Separación

Cromatografía de Adsorción

La cromatografía de adsorción permite la separación de una mezcla de solutos basándose en la diferencia de velocidad con la que estos se mueven a través de una fase estacionaria activa (sílica gel o alúmina). Esto se debe a la diferente capacidad de adsorción que presentan los diferentes solutos en dicha fase estacionaria. La adsorción depende del tipo de interacción que pueda presentar el soluto con la fase estacionaria (interacciones puente de hidrógeno, dipolo-dipolo, etc.). Cuanto mayor es la intensidad de dicha fuerza, mayor será la adsorción del soluto sobre la fase estacionaria, por lo cual su velocidad de desplazamiento disminuye (el soluto queda más retenido). La velocidad de desplazamiento también depende de la naturaleza del solvente y de las interacciones que este presente en el soluto.

Cromatografía de Exclusión Molecular

(Cromatografía de filtración en gel) Este tipo de cromatografía realiza el fraccionamiento de acuerdo al tamaño de las moléculas en lugar de las propiedades químicas. A menudo, constituye un método adecuado para separar las macromoléculas de tamaño diferente o para eliminar los contaminantes de bajo peso molecular de las disoluciones de moléculas grandes.

En esta técnica, la fase estacionaria está constituida por gránulos de un material esponjoso hidratado, que contiene poros que comprenden un intervalo de tamaños, relativamente reducido, de dimensiones moleculares.

Si por una columna que contenga estos "tamices moleculares" se hace atravesar una disolución acuosa que contenga moléculas de varios tamaños, las moléculas que sean demasiado grandes para atravesar los poros quedarán excluidas del volumen del disolvente contenido en el interior de los gránulos del gel. Estas moléculas más grandes atravesarán la columna más rápidamente, es decir, en un volumen de eluyente menor que las moléculas que circulan a través de los poros.

Esta técnica es simple, rápida y más económica que otro tipo de cromatografías. Sin embargo, el rango de sustancias que se pueden separar está limitado por el máximo del tamaño de los poros de la matriz. Además, no es adecuada para soluciones muy viscosas que afectan la eficiente difusión y migración de moléculas.

Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)

Uno de los avances más significativos de estos últimos años en el campo de la cromatografía ha sido la introducción de la cromatografía líquida de alta resolución. Originalmente, se diseñó para separar pequeñas moléculas orgánicas solubles en solventes no acuosos, aunque rápidamente se adecuó para la separación de compuestos biológicos de mayor tamaño solubles en agua. Ahora, y debido al desarrollo de soportes macroporosos, la técnica se puede aplicar a moléculas tan grandes como proteínas y ácidos nucleicos.

La alta eficacia de las columnas de HPLC se deriva del pequeño tamaño de sus partículas. Este pequeño tamaño necesita presiones altas para obtener velocidades de flujo adecuadas.

1. Previo a la Cromatografía

1) Medición de la Columna:

Se mide el largo y diámetro interno de la columna y se anotan esos valores.

2) Preparación de los Tubos:

Se agregan 5 ml de agua destilada en un tubo de ensayo y luego se marca el nivel del agua en el tubo. Finalmente, se replica la marca de nivel de agua en los tubos que se van a utilizar para la cromatografía (20 tubos).

2. Aplicación de la Muestra a Separar

3) Lavado de la Columna:

Se realiza un lavado de la columna con aproximadamente 20 ml de tampón fosfato como fase móvil, siguiendo las indicaciones de los profesores.

4) Aplicación de la Muestra:

Se deposita aproximadamente 0,5 ml de la muestra sobre la superficie de la columna y se agrega continuamente tampón fosfato, cuidando de mantener en todo momento un flujo constante de tampón y evitando que la columna se seque.

5) Recolección de Fracciones:

Se recogen fracciones de 5 ml por cada tubo de ensayo hasta que toda la muestra sea eluída de la columna.

3. Medidas de Absorbancia

El volumen eluído debe medirse a partir del momento en que se fija la muestra en la columna. Desde que se deposita la muestra se debe comenzar con la recolección en los tubos.

Se mide la absorbancia de los distintos tubos recogidos a dos longitudes de onda: la primera es a 420 nm, donde será posible cuantificar la hemoglobina, y la segunda a 580 nm para cuantificar el DCPIP, de acuerdo a las instrucciones entregadas por los profesores.