Cultivo Celular: Técnicas y Procedimientos

Cultivo Celular

1. Tipos de Cultivo

a) Según la adhesión de las células:

• Cultivos en monocapa: Las células crecen adheridas a una superficie sólida.
• Cultivos en suspensión: Las células crecen flotando en el medio de cultivo.

b) Según el soporte utilizado:

• Más usados: Vidrio y plástico (irradiación para su esterilización y riesgo de contaminación).
• Otros:
  • Metales (cultivos de células de la glía).
  • Matrices 3D (materiales que forman estructuras 3D porosas como geles de colágeno o esponjas de celulosa, las células crecen de forma parecida a la de su tejido de procedencia).
  • Microesferas de Sephadex/poliacrilamida (las células se adhieren a ellas y así se cultivan células dependientes de anclaje como si fuese cultivo en suspensión).

c) Características y tipos de recipientes de cultivo: Lo más característico es la superficie útil de cultivo. Más habituales:

1. Placas multipocillo: Número variable de pocillos, fondo no hermético y tapa no hermética. Mala estanqueidad y más riesgo de contaminación. * Placa Transwell: Tiene cámaras individuales que encajan en los pocillos y su fondo es una membrana plástica porosa, útiles para células epiteliales polarizadas y estudios de migración e invasión.
2. Placas Petri: Placas de cultivo circulares con tapa y misma utilidad que las multipocillo.
3. Frascos o botellas Roux: Planos con tapón de rosca, se pueden hacer cultivos cerrados o abiertos que permiten intercambio gaseoso y previenen la contaminación.
4. Botellas para incubadores Roller: Cilíndricas con gran superficie de crecimiento que se incuban sobre rodillos que las hacen girar lentamente.

d) Tratamiento de la superficie: Para mejorar la adhesión de las células se tratan con proteínas de matriz (colágeno y laminina) y proteínas naturales (gelatina y polilisina).

2. Composición y Propiedades del Medio de Cultivo

a) Composición:

1. Sales minerales (NaCl, KCl, CaCl₂, MgCl₂ y NaHCO₃ que regula el pH con la [CO₂] ambiental).
2. Tampón HEPES.
3. Aminoácidos esenciales.
4. Vitaminas para la tasa de crecimiento y supervivencia.
5. Indicador de pH: Rojo fenol.
6. Hormonas y factores de crecimiento.
7. Antibióticos y antifúngicos.

b) Características fisicoquímicas:

• pH óptimo: 7,2.
• Osmolaridad.
• Viscosidad: Depende de la [suero].
• Tensión superficial: Debe mantenerse baja.

* Atmósfera gaseosa: Mezcla de gases que se mantienen en los cultivos, el CO₂ está en equilibrio con el ion bicarbonato, por lo que puede influir en el pH si el medio está tamponado.

* Condiciones de incubación: Se controla:

• Temperatura: La óptima suele ser la misma a la que se someten las células.
• Humedad elevada para evitar la evaporación del medio.

Procedimientos de Cultivo Celular

1. Disgregación Celular

Separa las células entre sí y de su matriz extracelular. Métodos:

1. Mecánicos:
   • Cortar suavemente fragmentos de órganos colocados sobre una placa Petri con tampón/medio en donde se recogen las células tras filtrado.
   • Cribado de células:
     1. Poner trozos sobre nailon con diámetro de poro que permita el paso de las células.
     2. Aplanar suavemente.
     3. Acoplar a un tubo Falcon sobre una placa Petri.
     4. Lavar con tampón.
2. Enzimáticos: Tratamiento con enzimas proteolíticas que digieren proteínas, tripsina, colagenasa. La selección de células está basada en propiedades específicas (según distinta adhesión a sustrato) o métodos inmunológicos (anticuerpos anclados a soporte sólido).

2. Recuento y Viabilidad Celular

Para iniciar un cultivo celular hay que conocer la densidad celular y confirmar que las células están vivas.

• Colorante vital: Distingue células vivas de muertas. El azul tripán penetra en células con membrana rota (células no viables), azules.
• Conteo en hemocitómetro, cámara de Neubauer (portaobjetos de grosor superior que tiene en el centro una depresión central hundida aislada por dos surcos laterales y dividida por un surco central, cada una es una cámara de conteo).

3. Descongelación de Células

Para iniciar cultivos celulares a partir de líneas celulares mantenidas en congelación.

4. Inicio del Cultivo

Mantenimiento del Cultivo

Control periódico microscópico con invertido, cambio de medio (2/3 del volumen), subcultivo o pase (tras 6/7 días el crecimiento se detiene).

• En cultivos en suspensión: Recuento de viables y factor de dilución para que la densidad sea adecuada o el tamaño más grande.
• Monocapa: Despegar las células con tripsinización (tripsina + EDTA).