¿Qué colorante se usa para comprobar la viabilidad celular?

Se utiliza un colorante vital. Al observar el cultivo al microscopio, las células azules son no viables y las blancas son viables.

¿Para qué sirve el EDTA en el subcultivo?

El EDTA retira los iones Ca2+ que estabilizan la interacción entre las células y el sustrato, lo que facilita despegarlas junto con la tripsina.

¿Cuál es la función del centrómero?

El centrómero es el estrechamiento que divide el cromosoma en dos brazos. En él cada cromátida presenta el cinetocoro, que es el punto de anclaje de los microtúbulos.

Cultivo celular: técnicas de disgregación, viabilidad y estructura del cromosoma

Resumen

El documento describe las técnicas básicas del cultivo celular: disgregación de tejidos por métodos mecánicos y enzimáticos, recuento y comprobación de la viabilidad con colorante vital, descongelación, inicio y mantenimiento de cultivos, y conservación por congelación. Después introduce la citogenética y la estructura del cromosoma metafásico, con sus cromátidas, centrómero, constricciones secundarias y telómeros.

Puntos clave

La disgregación celular separa las células de la matriz extracelular mediante métodos mecánicos (criba, aplastado, lavado) o enzimáticos (tripsina, colagenasa, papaína).
La viabilidad se comprueba con un colorante vital: las células azules son no viables y las blancas son viables.
En cultivos de monocapa, el pase se realiza aproximadamente una vez por semana con tripsina y EDTA: la tripsina digiere las proteínas de adhesión y el EDTA retira los Ca2+ que estabilizan la unión célula-sustrato.
El medio de cultivo se cambia cada 2 o 3 días y el método habitual de conservación es la congelación.
La citogenética estudia la estructura, función y comportamiento de los cromosomas, y se observa en metafase, cuando el cromosoma está más compactado.
El centrómero divide el cromosoma en dos brazos y en él se sitúa el cinetocoro, punto de anclaje de los microtúbulos; los telómeros, en los extremos, están formados por repeticiones de una misma secuencia.

Ponte a prueba

Disgregación Celular

La disgregación celular consiste en la separación de las células de la matriz extracelular en la que se encuentran inmersas. Se puede realizar por métodos:

Métodos de Disgregación

Mecánicos:
- Colocar los trozos de órganos o tejidos sobre una criba metálica de poro que permita el paso de las células.
- Aplastar suavemente el tejido.
- Colocar la criba sobre la placa de Petri.
- Lavar con un tampón de manera que las células pasen a la placa de Petri.
Enzimáticos: Se basa en la utilización de enzimas proteolíticas que digieren la matriz extracelular liberando las células contenidas en estas. Las proteasas más utilizadas son:
- Tripsina
- Colagenasa
- Papaína

Recuento y Viabilidad Celular

Una vez conseguida la suspensión celular, debemos conocer su densidad. Además, habría que comprobar la viabilidad de estas células. Para comprobar la viabilidad se utiliza un colorante vital. Al observar el cultivo con microscopio se ven dos tipos de células: azules (no viables) y blancas (viables).

Descongelación de Células

Proceso necesario para iniciar cultivos secundarios a partir de técnicas celulares en congelación. Se realizan varios pasos:

Incubar las células congeladas en un baño a 37 grados.
Limpiar la superficie del vial con etanol para eliminar contaminantes.
Transferir a un tubo de 15 mililitros y añadir 10 mililitros de medio de cultivo a 37 grados.
Centrifugar.
Eliminar el sobrenadante.
Añadir 5 ml de medio de cultivo.

Inicio del Cultivo

Se inicia sembrando un número determinado de células en unas determinadas condiciones de temperatura, humedad y concentración de CO2.

Mantenimiento del Cultivo

Se realiza mediante los siguientes procesos:

Control periódico microscópico: Para observar la apariencia y crecimiento de las células.
Cambio de medio: Cada 2 o 3 días se cambia el volumen.
Subcultivo o pases: Aproximadamente una vez por semana debemos realizar un pase porque el crecimiento se detiene por confluencia de las células o por aumento de la densidad celular. En los cultivos de monocapa, para despegar las células de la superficie se utilizan: métodos mecánicos y métodos enzimáticos, despegando mediante una solución de tripsina y EDTA. La tripsina digiere las proteínas responsables de la adhesión a la superficie y el EDTA retira los Ca2+ que estabilizan la interacción de células-sustrato.

Conservación de Células

El método más habitual es la congelación.

Citogenética

Es la rama de la genética centrada en el estudio de la estructura, función y comportamiento de los cromosomas.

Cromosomas

El cromosoma de una célula eucariota está formado por la asociación de una molécula lineal de ADN que porta parte de la información genética del individuo y un conjunto de proteínas. El estudio citogenético se lleva a cabo en el período de metafase, cuando el cromosoma adquiere el máximo grado de compactación.

Estructura del Cromosoma Metafásico

Cromátidas: Son dos filamentos lineales y paralelos exactamente iguales. Cada cromátida es una de las dos moléculas de ADN idénticas resultantes de la replicación del ADN previo a la división celular.
Centrómero: Estrechamiento que divide el cromosoma en dos brazos. Es una región rica en ADN repetitivo. En el centrómero cada cromátida presenta una estructura proteica denominada cinetocoro, que es el punto de anclaje de los microtúbulos.
Constricciones secundarias: Son estrechamientos de las cromátidas menos profundos que el centrómero.
Telómeros: Extremo de las cromátidas. Están constituidos por miles de repeticiones de una misma secuencia y tienen funciones en la replicación del cromosoma y en su interacción con la membrana nuclear.

Tipos de Cromosomas

Los cromosomas metafásicos se observan como estructuras alargadas divididas en dos brazos por el centrómero. La longitud de cada brazo la marca la posición del centrómero. Teniendo en cuenta la longitud de ambos brazos se define la relación entre la longitud del brazo corto y la longitud total del cromosoma.