Cultivos Celulares: Características, Componentes y Técnicas

El Laboratorio de Cultivos Celulares

Características

• Localizado en una zona tranquila y con paso reducido de personas -> Baja probabilidad de contaminación cruzada
• Puede disponer de una presa para tareas que no necesitan una esterilidad tan extrema.
• Dedicado exclusivamente al cultivo celular.
• Se trabaja bajo un gradiente de presión negativa.

Medios Base

• Aporta a las células los nutrientes mínimos: solución salina, aminoácidos, vitaminas, glucosa, suero, etc.
• También suele contener antibióticos y antifúngicos -> Evitan el crecimiento de bacterias y hongos
• Ejemplo de medio base: Eagle's Basal Medium.

El medio base puede contener otros tipos de componentes:

• Antibióticos
• Tampón de pH
• Indicador de pH
• Suero fetal (osmoregulador)
• Aditivos específicos (suplementos de aminoácidos esenciales)

Propiedades:

• CO2 al 5% y HCO3
• Un pH entre 7.0 - 7.7 -> Indicador Rojo fenol
• Una osmolaridad entre 290 - 320 mOsm/ Kg
• La temperatura de incubación depende del organismo original del cultivo.
• La viscosidad -> Relacionada con el contenido en el suero
• La tensión superficial -> Debe ser baja -> Evita formación de espumas

Otros Elementos Necesarios para Obtener un Cultivo Celular

1. Recipiente contenedor del medio de cultivo
2. Sustrato sobre el que depositar el cultivo celular para que se pueda desarrollar
3. Fase gaseosa (Debe contener):
   • Oxígeno: necesario para la supervivencia del cultivo celular.
   • Dióxido de carbono: clave para una buena regulación del pH al cultivo celular

Características de las Células de un Cultivo Celular

• Deben de poderse disgregar.
• Deben de poder adherirse al sustrato.
• Deben de poderse dividir con una alta tasa de crecimiento.
• Deben de ser sensibles a inhibidores y/o estimulantes de crecimiento.

El Crecimiento de los Diferentes Tipos de Cultivos Celulares

• Las células en cultivo crecen hasta ocupar toda la superficie disponible en el recipiente del cultivo celular.
• Modificando la cantidad y/o tipos de factores de crecimiento -> Células embrionarias pueden especializarse
• Una gran densidad celular -> Puede limitar o frenar el crecimiento celular del cultivo -> Inhibición por contacto
• La mayoría de las líneas celulares tienen vida finita -> Entre 20 y 100 generaciones antes de la senescencia y muerte
• Algunas líneas celulares tienen vida infinita -> Células transformadas

Características de los Cultivos con Líneas Celulares Transformadas

• Son inmortales -> Crecen indefinidamente
• Tienen un crecimiento aberrante -> No les afecta la densidad celular ni ausencia de sustrato
• Provienen de líneas celulares malignas -> Tienen capacidad invasiva y de generar tumores
• Son genéticamente inestables -> Heteroploïdes y con aberraciones cromosómicas

Técnicas de Transferencia Genética para Obtener Células Transformadas

• Nos permiten introducir genes externos en el genoma de determinadas unidades orgánicas.
• Según el tipo celular que se transforme, podemos diferenciar:

Métodos Directos:

• Permiten transformar las células introduciendo directamente el gen de interés.
• Tipos:
  1. Liposomas
  2. Biolística
  3. Electroporación
  4. Sonicación
  5. Uso de protoplastos, etc

Métodos Indirectos:

• Permiten transformar las células introduciendo el gen de interés mediante un vector.
• Tipos:
  1. Plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens
  2. Plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes
  3. Vectores virales -> Fitovirus
  4. Vectores transposones

Clonación/Transgénesis

• Consiste en obtener cultivos donde todas las células tienen el mismo genoma.

• Procedimiento:

  1. Obtener un gen de interés.
  2. Unir este gen a un vector de transferencia -> Plásmidos, YACs, BACs...
  3. Introducir el vector a la célula “target”.
  4. Seleccionar las células transformadas.

• Estas células y sus descendientes tendrán el mismo genoma -> Clones

• El vector se puede introducir en la célula target utilizando técnicas, como:

  1. Microinyección
  2. Vectores virales
  3. Electroporación
  4. Liposomas, Etc.

Técnicas para la Caracterización de los Cultivos Celulares

• Nos permiten determinar las propiedades morfológicas, estructurales y bioquímicas de un cultivo celular.
• Tipos:
  1. Inmunofluorescencia -> Por ejemplo: GFP (Green fluorescence protein)
  2. Citometría -> Por ejemplo: Citometría de flujo
  3. Pruebas bioquímicas -> Por ejemplo: Reacciones enzimáticas, etc

Técnicas para la Cuantificación de las Células de los Cultivos Celulares

• Nos permiten determinar el número de células presentes en un cultivo celular -> Densidad celular
• Tipos:
  1. Cámara de Neubauer
  2. Citometría de flujo
  3. Tinción diferencial
  4. Contador de células automático, etc