Electroforesis de Ácidos Nucleicos: Tipos de Geles y Aplicaciones
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Electroforesis de Ácidos Nucleicos
El principio de la electroforesis consiste en la migración proporcional de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz porosa, según su peso molecular o tamaño; movimiento generado por el campo eléctrico.
Componentes de la Electroforesis
Cámara de Electroforesis
Dispositivo que permite la generación de un campo eléctrico alrededor de un gel donde se depositan las muestras. Se genera dentro de una solución amortiguadora en la que se encuentra sumergido el gel que contiene las muestras; el alto contenido de electrolitos permite la transmisión de la corriente eléctrica, manteniendo el pH estable.
Cuenta con dos polos que se conectan a una fuente de energía.
En las cámaras de electroforesis vertical, el polo positivo se encuentra en la parte inferior de la cámara.
Gel
La muestra debe colocarse sobre un medio de soporte para evitar perturbaciones durante la separación.
Soporte idóneo: gel semisólido o gelatinoso.
Permite la separación por tamaño de los diferentes componentes de la muestra.
Puede ser de agarosa o poliacrilamida.
Para la separación de ADN se usan geles de agarosa o acrilamida, y para proteínas, solo de acrilamida.
Geles de Agarosa
Agarosa: polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente, se disuelve a temperatura de 50-60º y se solidifica cuando se enfría, formando un gel altamente poroso.
La agarosa posee ventajas sobre la acrilamida. No es un compuesto tóxico y permite realizar el análisis de ADN con pesos moleculares variados.
Sin embargo, su poder de resolución es menor que el de los geles de poliacrilamida. La concentración de agarosa se escoge según el tamaño del ADN que se vaya a analizar.
El tamaño de los poros del gel depende de la concentración de agarosa usada. Dicha concentración es inversamente proporcional al tamaño del poro obtenido. Si los poros son pequeños, la migración del ácido es más lenta.
El ADN con un peso molecular alto migra al ánodo más lentamente que los de menor peso molecular.
La concentración de agarosa más usada para electroforesis de ADN es de 0.5-2%.
Geles de Acrilamida (PAGE)
Acrilamida: polímero sintético, termoestable, incoloro y químicamente inerte, con el que se puede generar geles con un amplio intervalo de tamaños de poro. El gel es el resultado de la polimerización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida.
El tamaño de poro está determinado por la concentración total de acrilamida. Se consiguen distintas porosidades, siempre menores que las de los geles de agarosa.
La formación del gel requiere que varias cadenas queden trabadas.
La acrilamida es una neurotoxina, por lo que debe manejarse con precaución.
El gel de acrilamida es capaz de soportar mayores voltajes que la agarosa y es susceptible de teñirse por varios procedimientos; también puede desteñirse en caso necesario. Pueden digerirse para extraer bandas o desecarse para su exposición radiográfica y registro.
La electroforesis con geles de acrilamida siempre se realiza en cámaras verticales.
La electroforesis de proteínas emplea geles de acrilamida.