Electroforesis en Geles de Agarosa: Fundamentos y Aplicaciones en Biología Molecular

Principios de la Electroforesis

La electroforesis se fundamenta en la separación de moléculas al ser sometidas a un campo eléctrico. Estas migran a diferentes velocidades según su tamaño, forma y carga.

Impacto del Porcentaje de Agarosa en la Separación de ADN

El porcentaje de agarosa en el gel afecta directamente la eficiencia de la migración del ADN. A mayor porcentaje de agarosa, se logra la separación de fragmentos de ADN más pequeños, debido a una matriz de poros más densa.

Formas del ADN y su Migración en el Gel

Para una muestra de ADN con un tamaño de pares de bases entre 400 y 8000 pb, se pueden observar tres bandas principales que el ADN puede adoptar en el gel:

1. ADN circular superenrollado: Esta forma, al estar más condensada, migra más rápidamente a través del gel.
2. ADN circular cortado (o relajado): Presenta una migración intermedia.
3. ADN lineal: Generalmente migra más lentamente que la forma superenrollada, pero más rápido que la forma circular cortada de igual peso molecular.

Purificación de ADN Plasmidial y Estructura del Genoma

El ADN consiste en dos largas cadenas polinucleotídicas compuestas de cuatro tipos de subunidades nucleotídicas. Las dos hebras se sostienen mediante uniones de puentes de hidrógeno formados entre las bases nitrogenadas de los nucleótidos de cada cadena. El contenido total de ADN de un organismo se denomina genoma. Por ejemplo, el genoma nuclear humano es de aproximadamente 3x10⁹ nucleótidos.

Características del Genoma Bacteriano y Plásmidos

El genoma bacteriano, con aproximadamente 4.2x10⁶ bases, contiene sus genes en una molécula de doble hebra circular asociada a proteínas, constituyendo así el cromosoma bacteriano. Los plasmidios son moléculas de ADN extracromosómico que contienen su propio origen de replicación, lo que les permite multiplicarse de forma independiente al cromosoma bacteriano.

Propiedades y Ventajas de la Agarosa

La agarosa es un polímero ampliamente utilizado en electroforesis debido a sus múltiples ventajas:

• No es tóxica: Lo que la hace segura para el manejo en laboratorio.
• Versatilidad: Permite el estudio de ácidos nucleicos con pesos moleculares muy variados.
• Poder de resolución: Aunque su poder de resolución es menor que el de los geles de poliacrilamida, es adecuado para fragmentos grandes.
• Concentración: Se utiliza en concentraciones que varían del 0.5% al 2%, elegidas según el tamaño del ácido nucleico a analizar. La concentración de agarosa define el tamaño de los poros de la matriz: a mayor concentración, menor tamaño de los poros y viceversa.
• Comportamiento como tamiz molecular: Las moléculas de ADN, al ser sometidas a electroforesis, se desplazarán hacia el polo positivo, ya que a pH superiores a 5 poseen carga negativa. Los geles actúan como un tamiz molecular, separando las moléculas por tamaño.

Métodos de Visualización de Bandas de ADN

Las bandas de ADN en el gel se visualizan añadiendo bromuro de etidio u otra molécula intercalante entre las bases del ADN. Este compuesto es fluorescente cuando se excita con luz ultravioleta (UV). La visualización se realiza con una lámpara de luz UV, donde se observarán las bandas correspondientes a la muestra de ADN aplicada.

Dinámica de Migración del ADN en Geles de Agarosa

La migración de moléculas lineales de ADN de doble hebra a través del campo eléctrico en un gel de agarosa es inversamente proporcional al logaritmo del número de pares de bases en un cierto rango. Esto significa que las moléculas más grandes migran más lentamente debido a una mayor fuerza de fricción con la matriz del gel.