Electroforesis: Principios, Componentes y Aplicación en Separación Molecular

Introducción a la Electroforesis

La electroforesis es una técnica analítica de separación fundamental, utilizada para separar macromoléculas en disolución, como proteínas y ácidos nucleicos, basándose en su carga y tamaño bajo la influencia de un campo eléctrico.

Componentes Clave de un Sistema de Electroforesis

Un sistema de electroforesis se compone de varios elementos esenciales que trabajan en conjunto para lograr la separación molecular:

• Fuente de Alimentación Eléctrica

  La fuente de alimentación eléctrica es la encargada de proporcionar la diferencia de potencial (ddp) necesaria para que los componentes de la mezcla migren. De ella salen dos electrodos: el cable negro se conecta al polo negativo (-) y el cable rojo al polo positivo (+). Estos se conectan a los recipientes de la cubeta.

• Cubeta de Electroforesis

  La cubeta contiene dos recipientes a los que se conectan los electrodos. En estos recipientes se coloca el tampón, una solución que mantiene el pH constante y conduce la corriente. Durante el proceso, se produce la electrólisis del agua; el tampón es crucial para evitar la acidificación del ánodo y la basificación del cátodo. La cubeta también incluye un puente donde se deposita la muestra. Es preferible que las muestras sean pequeñas para minimizar la evaporación y las diferencias de temperatura entre cubetas, lo que podría afectar la integridad de las muestras. Cuando no se utilizan, las cubetas deben estar secas y limpias para evitar contaminaciones o daños.

• Soporte o Matriz

  El soporte es la matriz porosa (comúnmente un gel de agarosa o poliacrilamida) donde se coloca la muestra y a través de la cual migran las moléculas. Se sitúa sobre el puente de la cubeta y está en contacto con el tampón. Debe ser inerte para no interferir con la migración de las moléculas y permitir una separación eficiente.

Principios de la Movilidad Electroforética

La movilidad electroforética de una molécula es un factor clave en su separación y está determinada por varias propiedades:

• Es directamente proporcional a la carga neta de la molécula.
• Es inversamente proporcional al tamaño y la forma de la molécula.
• Es inversamente proporcional a la viscosidad del medio (el soporte y el tampón).

En términos generales, cuanto mayor sea la relación entre la carga y el tamaño de una molécula, más rápido migrará el ión. Asimismo, la velocidad de migración aumentará si el campo eléctrico aplicado es más grande.

Procedimiento de Electroforesis: Preparación y Ejecución

La realización de una electroforesis implica una serie de pasos meticulosos para asegurar resultados precisos:

1. Preparación de la Muestra

   La preparación de la muestra es fundamental. Implica la aplicación de medios de separación o concentración para obtener una muestra con la concentración adecuada para la detección y separación.

2. Preparación del Soporte

   Para la preparación del soporte (especialmente en el caso de geles), es necesario prepararlo con la composición adecuada (porcentaje de gel, agentes desnaturalizantes, etc.), verterlo en un molde y asegurar que tenga un grosor y textura óptimos para la migración.

3. Preparación del Tampón

   Si no se utiliza un tampón comercial, se deben preparar las disoluciones del tampón con la concentración y pH correctos. El tampón debe llenar los recipientes de la cubeta y cubrir el soporte.

4. Siembra de la Muestra

   Una vez preparados todos los componentes, se procede a la siembra de la muestra. Si las moléculas tienen carga positiva (+), se colocan cerca del ánodo para que migren hacia el cátodo, y viceversa. La técnica de siembra depende del soporte: a veces se utilizan pocillos preformados donde la muestra se deposita con una micropipeta, y otras veces se deposita una pequeña cantidad controlada directamente en el medio del soporte.

5. Selección de Parámetros Eléctricos y Tiempo

   Finalmente, se seleccionan los parámetros eléctricos (voltaje, corriente) y el tiempo de corrida, poniendo en marcha el equipo. Una vez en funcionamiento, las sustancias comienzan a migrar a través del medio del soporte bajo la influencia del campo eléctrico.

Interpretación de Resultados y Cuantificación

El resultado de la electroforesis se observa visualmente como bandas o manchas separadas en el soporte, donde cada una corresponde a una sustancia diferente o a un grupo de sustancias con propiedades de migración similares. Posteriormente, se realiza el revelado, que generalmente implica la adición de un colorante específico para las moléculas de interés (ej. Coomassie Blue para proteínas, bromuro de etidio para ADN) y un lavado para eliminar el exceso de colorante.

Tras el revelado, es fundamental interpretar la información obtenida. Dependiendo de los objetivos del experimento, se puede proceder a una cuantificación de las bandas mediante técnicas como la espectrofotometría (si las bandas se eluyen) o la densitometría (escaneando la intensidad de las bandas directamente en el gel), lo que permite determinar la cantidad relativa o absoluta de cada componente separado.