Electroforesis: Principios, Tipos y Aplicaciones en Bioquímica

Electroforesis

La electroforesis es una técnica de separación que se basa en la diferente movilidad o velocidad de migración de partículas cargadas debido a la acción de un campo eléctrico.

Campo eléctrico (E)

El campo eléctrico es el entorno generado por cargas eléctricas, que influye en el movimiento de otras partículas cargadas.

Fenómenos que afectan la separación de las sustancias

Varios fenómenos influyen en la separación de sustancias durante la electroforesis:

• Difusión

  • Es un fenómeno provocado por la existencia de gradientes de concentración que favorecen el transporte hacia las zonas de menor concentración de cada especie.
  • Afecta tanto a partículas cargadas como no cargadas.
  • Las moléculas tienden a moverse de forma aleatoria debido a que poseen energía cinética propia.
  • Con un aumento de la temperatura, aumentará la difusión por un incremento de la energía cinética.

• Migración

  • Es el movimiento producido por una fuerza externa que es impuesta al medio, en este caso, el campo eléctrico y su intensidad.

• Flujo térmico

  • Al pasar una corriente eléctrica a través de un sistema que origina una resistencia dada, se produce calor.
  • El sistema electroforético no es isotérmico.
  • En general, la fase líquida se mueve hacia las zonas de menor temperatura, lo que origina un transporte de las partículas de interés no debido a la migración.

• Fricción

  • La fricción con el solvente dificultará el movimiento, lo que genera una fuerza que se opone al movimiento.
  • Las moléculas no migran de manera uniforme, de modo que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de la solución, los iones comenzarán a moverse formando un frente cuya anchura aumentará con el tiempo.

Soluciones al fenómeno de fricción

• Reducir el movimiento de las moléculas.
• Reducir el ancho empleando un medio que oponga más resistencia a dicho movimiento.

Esta situación nos permite diferenciar dos métodos electroforéticos:

• Electroforesis convencional
• Electroforesis capilar

Electroforesis convencional

Es una metodología clásica que ha sido utilizada durante muchos años para separar especies complejas, de elevado peso molecular, de interés biológico y bioquímico.

Las separaciones convencionales se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana o placa de un gel poroso que contiene un tampón acuoso en el interior de sus poros.

Normalmente, esta placa tiene unas dimensiones de unos pocos centímetros de lado, y al igual que las placas de cromatografía en capa fina, es capaz de separar varias muestras simultáneamente.

Las muestras se disponen como manchas o bandas sobre la placa (o gel), y se aplica el potencial de corriente continua, a través de la placa, durante un período de tiempo fijo.

El tampón acuoso al interior de los poros será la sustancia encargada de ofrecer resistencia al movimiento de las moléculas, controlando así su migración uniforme.

Se pueden separar varias muestras simultáneamente.

Cuando se juzga que las separaciones se han completado, se interrumpe el paso de la corriente, y las especies separadas se detienen para visualizarse de modo similar.

La electroforesis convencional es una técnica de separación ampliamente utilizada por biólogos y bioquímicos.

Los geles son redes tridimensionales de polímeros ramificados que tienen los espacios entre ramificación rellenos de líquido.

Las redes de polímeros no solo reprimen la convección, sino que también actúan como coladores que pueden retardar y hasta bloquear la migración de los analitos poliméricos más grandes.

En cambio, los iones pequeños pueden moverse libremente a través de la estructura porosa del gel.

De este modo, la electroforesis en gel tiene dos mecanismos de separación:

• Electroforesis, que separa por la relación carga/tamaño.
• Tamizado, que separa mayormente por tamaño.

Los geles más comunes son agarosa y poliacrilamida.

Desventajas de la electroforesis convencional

• Campos eléctricos bajos
• Resolución baja
• Tiempos de análisis elevados