Errores y principios en inmunoensayos: efecto matriz, efecto hook, inmunocromatografía y electrotransferencia

Efecto matriz

Efecto matriz: sustancias presentes en la muestra que interfieren en la reacción (proteínas, complemento, autoanticuerpos, anticuerpos heterófilos). Ejemplo: una albúmina alta puede alterar la determinación de hormonas tiroideas.

Especificidad de anticuerpos

Especificidad anticuerpos: los anticuerpos policlonales son menos específicos; los anticuerpos monoclonales son muy específicos, pero pueden no reconocer variantes antigénicas.

Efecto hook (gancho)

Efecto hook: en concentraciones muy altas de antígeno puede producirse la saturación de anticuerpos, lo que lleva a resultados falsamente bajos. Se corrige diluyendo la muestra.

Inmunocromatografía

INMUNOCROMATOGRAFÍA: técnica para detectar proteínas con carácter antigénico. Se utiliza como soporte una tira de nitrocelulosa.

Soporte y zonas

• Primera zona: zona de depósito de la muestra. Contiene anticuerpos de conejo dirigidos contra el antígeno de interés en forma libre; estos anticuerpos están marcados con oro coloidal (también puede usarse látex u otros marcadores).
• Segunda zona (zona test): en la membrana están fijados los anticuerpos de conejo frente al mismo antígeno buscado.
• Tercera zona (zona control): fijados en la membrana hay anticuerpos anti-IgG de conejo que servirá como control de migración y reacción.

Proceso

1. La muestra, diluida en tampón, se coloca en la zona de inicio (zona 1).
2. Si la muestra contiene el antígeno buscado, este se une a los anticuerpos libres marcados (con oro coloidal), formando un complejo antígeno–anticuerpo marcado (Ag–Ac*).
3. Este complejo migra por capilaridad a lo largo de la tira.
4. Al llegar a la zona test (2), el complejo se une a los anticuerpos fijos, formando el complejo Ac (fijo) – Ag – Ac marcado, lo que genera una banda coloreada visible.
5. Los anticuerpos marcados libres (no unidos a antígeno) continúan migrando y llegan a la zona control (3), donde se unen a los anticuerpos anti-IgG, formando otra banda coloreada que confirma que la prueba funcionó correctamente.

Resultados

• Positivo: aparecen dos bandas coloreadas —zona test (2) y zona control (3).
• Negativo: aparece una sola banda, solo en la zona control.
• Inválido: si no aparece ninguna banda, la prueba no es válida.

Electrotransferencia (Western blot)

ELECTROTRANSFERENCIA: variante de Western blot. Técnica cualitativa y semicuantitativa utilizada para comparar diferentes muestras y para validar la especificidad de la detección.

Procedimiento

1. Preparación de la muestra: obtención del tejido o de células y preparación en tampón apropiado.
2. Electroforesis: separación por tamaño en un gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
3. Transferencia a membrana: transferencia a una membrana de nitrocelulosa por difusión, vacío o campo eléctrico; las proteínas, cargadas negativamente, migran hacia el polo positivo. El gel se coloca en contacto con la membrana porosa formando un sándwich que se introduce en un casete de transferencia con la membrana más cercana al polo positivo.
4. Inmunodetección: primer paso es bloquear los sitios no específicos de unión en la membrana con una proteína neutra (bloqueo). Esto es importante porque la membrana es una superficie muy adherente para proteínas y un anticuerpo libre podría unirse no específicamente. Se incuba la membrana con una solución de bloqueo, luego con el anticuerpo primario, se lava y se incuba con el anticuerpo secundario, seguido de nuevos lavados.
5. Detección de bandas: la detección y cuantificación dependen del marcador utilizado: enzimas (quimioluminiscencia), biotina, fluoróforos, etc.

En Southern o Northern se utiliza la técnica RIA. La FDA establece como criterio de positividad la presencia de determinadas bandas: p24+ y p32+.