Espectrofotometría: Fundamentos y Aplicaciones en la Determinación de Proteínas

Espectrofotometría

Principios Básicos

La espectrofotometría es la técnica que estudia la capacidad de las moléculas para absorber o emitir ondas electromagnéticas de una longitud de onda específica. Las propiedades de absorción se utilizan para medir la concentración de las moléculas en solución. Se basa en la interacción de la luz con la materia, y las regiones del espectro electromagnético más utilizadas son:

• Ultravioleta (200-400 nm)
• Visible (400-700 nm)
• Rojo cercano (700-800 nm)

Energía de la Onda Electromagnética

La energía de una onda electromagnética se define por la ecuación: E = hν, donde:

• E: energía
• h: constante de Planck
• ν: frecuencia de la onda

La luz UV y visible tiene la capacidad de excitar electrones enlazantes y no enlazantes desde su estado basal a un estado excitado de mayor energía. Las moléculas que contienen estos electrones absorben luz a una longitud de onda específica. Este fenómeno es particularmente relevante en moléculas conjugadas (dobles enlaces separados por enlaces simples). La conjugación aumenta la longitud de onda de absorción y disminuye la diferencia energética entre el estado basal y el excitado.

Cromóforo

Un cromóforo es la estructura de los enlaces conjugados que permite la absorción de luz.

Ley de Beer-Lambert

La Ley de Beer-Lambert establece que la absorción de luz es proporcional al número de moléculas de la sustancia absorbente en la solución por donde pasa un haz electromagnético. Se expresa mediante la siguiente ecuación:

A = εlc

Donde:

• A: absorbancia (adimensional, valores entre 0 y 1)
• ε: absortividad molar (constante para cada sustancia a cada longitud de onda)
• l: espesor de la capa absorbente (cm)
• c: concentración de la sustancia (moles/L o g/L)

La absorbancia es directamente proporcional a la concentración. Sin embargo, la linealidad de esta relación está limitada por factores químicos e instrumentales como:

1. Variaciones en la absortividad a altas concentraciones (>0.01 M) debido a interacciones electrostáticas entre moléculas cercanas.
2. Dispersión de la luz por la presencia de partículas en la muestra.
3. Fluorescencia.
4. Cambios en el equilibrio químico dependientes de la concentración (disociación del analito, reacciones).

Selección de la Longitud de Onda de Trabajo

La longitud de onda de trabajo (λ_max) es aquella en la cual la absorbancia del analito es máxima. Para seleccionarla, se utiliza una curva espectral, que es una gráfica de la absorbancia de una solución de la sustancia a diferentes longitudes de onda. Las sustancias coloreadas se miden en la región visible (380-800 nm), mientras que las no coloreadas se miden en la región ultravioleta (200-380 nm).

Curva de Calibración

La curva de calibración se utiliza para determinar la concentración de una muestra. Es una gráfica que relaciona la concentración de 5 soluciones de concentración conocida con la absorbancia de cada una a λ_max. La ecuación de la recta de calibración es:

A = mx + b

Donde:

• m: pendiente de la recta (absortividad x espesor de la cubeta)
• x: concentración del analito
• b: intercepto

Después de medir la absorbancia de la muestra, se puede reemplazar en la ecuación o interpolar en la gráfica para obtener la concentración.

Espectrofotómetro

Un espectrofotómetro mide la absorbancia a una longitud de onda fija y permite realizar barridos (mediciones a diferentes longitudes de onda en una sola operación) para obtener un espectro de absorbancia. Sus componentes principales son:

1. Fuentes de luz: Determinan la calidad del equipo. Se utilizan filtros para seleccionar la longitud de onda deseada. Los filtros de absorción se usan en la región visible y consisten en vidrio coloreado o suspensiones de gelatina. Los filtros de interferencia producen bandas de radiación más estrechas. Los monocromadores ofrecen la mejor calidad y utilizan redes de difracción o prismas.
2. Recipientes: Deben ser de un material que no interfiera con la radiación. Para la región ultravioleta (<350 nm) se utilizan cubetas de cuarzo. Entre 350 y 1000 nm se usan cubetas de vidrio de silicato. En la región visible (400-800 nm) se pueden usar cubetas de plástico.
3. Detector de radiación: Es un transductor que convierte la energía radiante en una señal eléctrica.
4. Procesador: Amplifica la señal del detector y la convierte en una lectura de absorbancia.

Determinación de Proteínas por Espectrofotometría

La espectrofotometría se utiliza para determinar la cantidad de proteínas en solución. Existen diferentes métodos:

Método de Bradford

Este método se basa en la formación de un complejo azul entre el colorante Coomassie G-250 y las proteínas. El colorante se une a residuos de arginina, triptofano, tirosina, histidina y fenilalanina. El complejo absorbe a 590 nm. Es compatible con agentes reductores, pero no con detergentes (excepto Triton X-100 no iónico a baja concentración). Rango de detección: 20-2000 μg/ml.

Absorción UV a 280 nm

Se basa en la absorción de la luz UV por los residuos de tirosina y triptófano. Rango de detección: 0.1-100 μg/ml. Requiere un volumen de muestra pequeño, es rápido y económico. Sin embargo, se ve afectado por la presencia de detergentes y presenta una alta variabilidad.

Método del Ácido Bicinconínico (BCA)

Se basa en la reducción de Cu⁺² a Cu⁺¹ por las proteínas. El complejo formado absorbe a 562 nm. Rango de detección: 20-2000 μg/ml. Es compatible con detergentes y agentes desnaturalizantes, pero no con agentes reductores. Presenta baja variabilidad.

Método de Lowry

Se basa en la reducción de Cu⁺² por las proteínas y la posterior reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu por el complejo formado. El complejo absorbe a 750 nm. Rango de detección: 10-1000 μg/ml. Presenta alta sensibilidad y precisión, pero se ve afectado por la presencia de detergentes y agentes reductores. Es un procedimiento largo.