Estrategias de Purificación de Proteínas Recombinantes: Desde la Expresión hasta la Cromatografía FPLC

Purificación de Proteínas Recombinantes: Sistemas de Expresión y Metodología

La purificación de proteínas recombinantes es un proceso crítico que comienza con la elección adecuada del sistema de expresión. Los sistemas hospederos disponibles en la actualidad para la expresión de proteínas incluyen:

Sistemas de Expresión de Proteínas Recombinantes

• Bacterias
• Levaduras
• Células vegetales
• Hongos filamentosos
• Células de insectos o mamíferos
• Plantas y animales transgénicos

Cada sistema hospedero posee sus propias ventajas y desventajas, lo cual debe considerarse antes de la elección final. La elección del hospedero afecta directamente la expresión de la proteína y la forma en que esta será purificada. Además, la elección del hospedero definirá el vector de expresión a utilizar, y si la proteína será producida como proteína de fusión o no.

Cosecha Celular y Extracción de Proteínas

El procedimiento de cosecha de las células hospederas y el método de extracción dependerán del origen de la proteína (bacteria, planta, mamífero) y de su localización (extracelular o intracelular).

Técnicas de Cosecha

La cosecha, que implica la remoción de las células del medio de cultivo, generalmente involucra técnicas de filtración, centrifugación o una combinación de ambas.

Estrategias de Preparación de Muestra según la Localización

1. Expresión Intracelular

Proteína Insoluble (Cuerpos de Inclusión)

1. Lisis celular
2. Eliminación de desechos celulares
3. Cosecha de cuerpos de inclusión
4. Solubilización
5. Purificación

Proteína Soluble en Citoplasma

1. Lisis celular
2. Eliminación de desechos celulares
3. Recuperación del sobrenadante
4. Purificación

2. Espacio Periplasmático

1. Disrupción de la pared celular
2. Eliminación de células
3. Recuperación de la muestra clarificada
4. Purificación

3. Expresión Extracelular (Medio de Cultivo)

1. Eliminación de células
2. Recuperación de la muestra clarificada
3. Purificación

Consideraciones Críticas en la Preparación de Muestra

Durante la preparación de la muestra, es fundamental tener en cuenta los siguientes riesgos que pueden comprometer la integridad de la proteína:

1. Desnaturalización de proteínas.
2. Liberación de enzimas proteolíticas.
3. Cambios drásticos de pH o temperatura.
4. Liberación de ácidos nucleicos.

Preparación de la Muestra para Purificación Cromatográfica

Para asegurar el éxito de la purificación mediante cromatografía, la muestra debe ser optimizada en tres aspectos clave:

• Estabilidad de la proteína: Ajuste de las condiciones (pH, fuerza iónica) para mantener la estabilidad de la proteína o péptido.
• Clarificación de la muestra: Eliminación de partículas mediante centrifugación, filtración o una combinación de ambas.
• Desalado de la proteína: Eliminación de sales e impurezas de bajo peso molecular utilizando filtración en centricón, diálisis o columnas específicas para desalar.

Equipamiento para Purificación de Proteínas: FPLC

La Cromatografía Líquida Rápida de Proteínas (FPLC), del inglés Fast Protein Liquid Chromatography, es una variante del HPLC. Utiliza columnas y equipamiento especialmente diseñado para separar o purificar proteínas. Es importante notar que las columnas de FPLC generalmente soportan menos presión que las utilizadas en HPLC.

Pasos Fundamentales de la Purificación por Afinidad (Cromatografía)

El proceso de purificación cromatográfica, especialmente en el contexto de proteínas etiquetadas (tagged), sigue una secuencia definida:

1. Equilibrio: El medio de afinidad se equilibra utilizando un buffer de unión específico.
2. Aplicación de Muestra y Lavado: La muestra se aplica bajo condiciones que favorecen la unión específica de la proteína marcada al ligando. El material no unido o inespecífico es eliminado mediante lavado.
3. Elución: Las condiciones del buffer se modifican (por ejemplo, cambiando el pH o la concentración de sal) para promover la elución de la proteína marcada. La proteína etiquetada recogida es la fracción purificada y concentrada.