Estudio Cromosómico: Del Cultivo Celular a la Identificación de Bandas

El Cariotipo y su Determinación

Definiciones Fundamentales

• Cariotipo: Conjunto de cromosomas de una especie, ordenados según su tamaño y morfología.
• Cariotipo de especie: El conjunto normal de cromosomas característico de una especie.
• Cariotipo constitucional: El conjunto cromosómico presente en la mayoría de las células de un organismo.
• Cariotipo de célula: El conjunto de cromosomas contenido en una célula individual.

En pacientes con cáncer, la realización de un cariotipo de células tumorales es crucial para obtener información relevante sobre el tratamiento, el pronóstico o la evolución de la enfermedad.

2. Cariotipo Estándar de Sangre Periférica

El cariotipo se obtiene a partir de una muestra de sangre periférica.

Cultivo de Linfocitos

La muestra de sangre periférica debe ser anticoagulada con heparina. Los medios de cultivo comúnmente utilizados son RPMI 1640, DMEM y Ham F10, suplementados con suero bovino fetal, L-glutamina y antibióticos (penicilina, estreptomicina). Los recipientes para el cultivo pueden ser frascos Roux o tubos de cultivo.

Procedimiento de Cultivo

1. Siembra: Añadir sangre heparinizada al medio de cultivo en una proporción de 1/5 o 1/10.
2. Adición de Fitohemaglutinina (PHA): Esta proteína se une a los linfocitos B, induciendo su proliferación y desdiferenciación.
3. Incubación: El cultivo se mantiene a 37°C con un 5% de CO2 durante 72 horas. Si se utilizan tubos de cultivo, estos se incuban a 45° en gradillas inclinadas.
4. Detención de la Mitosis en Metafase: Aproximadamente entre 2 y 3 horas antes de finalizar la incubación, se añade colchicina al cultivo. La colchicina detiene la mitosis en la fase de metafase al desorganizar los microtúbulos del huso mitótico.

Obtención de Extensiones de Metafases

1. Sacrificio del Cultivo: El contenido del cultivo se trasvasa a un tubo Falcon de 15 ml y se centrifuga a 1500 rpm durante 5-10 minutos. Se elimina el sobrenadante.
2. Choque Hipotónico e Incubación: Se añaden 5 ml de KCl 0,075 M, se mezcla y se incuba a 37°C durante 5-20 minutos. Este paso provoca que las células se carguen de agua y se hinchen. Posteriormente, se centrifuga a 1500 rpm durante 5-10 minutos y se elimina el sobrenadante.
3. Fijación y Lavado: Se utiliza el fijador de Carnoy (3:1 metanol:ácido acético). Se añaden 5 ml del fijador, se mezcla y se deja reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se centrifuga a 1500 rpm durante 5 minutos, se descarta el sobrenadante y se realizan 2-3 lavados con el fijador.
4. Obtención de Extensiones por Goteo: Las células fijadas se centrifugan, se elimina el sobrenadante y se resuspenden en 0,5-1 ml de fijador. Para obtener las extensiones, se carga la suspensión en una pipeta y se dejan caer una o dos gotas sobre un portaobjetos desde una altura de 30 cm. Las células se rompen y los cromosomas se dispersan, facilitando la observación de las metafases. Se deja secar al aire y el portaobjetos está listo para la tinción.

Tinción Convencional y Bandas Cromosómicas

Tinción con Giemsa

Los portaobjetos se sumergen en una solución de Giemsa al 3% en tampón fosfato (pH 6,7) durante 3-4 minutos. Esta tinción permite evaluar la calidad de las metafases antes de aplicar técnicas de bandeo.

Bandeo G (G-banding)

Las preparaciones deben ser envejecidas:

• En estufa a 60-65°C durante 1-2 días.
• O a 37°C durante 3-4 días.
• O a temperatura ambiente durante 7-10 días.

Pasos del Bandeo G:

1. Digestión con Tripsina: Las preparaciones envejecidas se sumergen en una solución de tripsina cuya concentración dependerá de la enzima utilizada. La digestión se detiene mediante lavado con PBS (Solución Salina Tamponada).
2. Tinción con Giemsa: Se sumergen las preparaciones en una solución tamponada de Giemsa.

Reactivos y Procedimiento para Bandeo G:

Sumergir las preparaciones envejecidas en tripsina (0,1 ml) en PBS durante 5-10 segundos. Lavar dos veces con PBS. Sumergir en Giemsa al 3% en tampón fosfato (pH 6,7) durante 5 minutos. Lavar con agua y secar.

Posteriormente, se procede al análisis, donde se cuentan los cromosomas, se ordenan y se emparejan.

Clasificación y Ordenación del Cariotipo

Los cromosomas se ordenan de mayor a menor tamaño. Se colocan primero los metacéntricos, seguidos de los submetacéntricos y, finalmente, los acrocéntricos.

• Grupo A: Cromosomas 1, 2, 3 (1 y 3 metacéntricos; 2 submetacéntrico).
• Grupo B: Cromosomas 4, 5 (submetacéntricos).
• Grupo C: Cromosomas 6 al 12 (submetacéntricos de tamaño mediano), incluyendo el cromosoma X.
• Grupo D: Cromosomas 13, 14, 15 (acrocéntricos de mayor tamaño).
• Grupo E: Cromosomas 16, 17, 18 (submetacéntricos pequeños).
• Grupo F: Cromosomas 19, 20 (metacéntricos más pequeños).
• Grupo G: Cromosomas 21, 22 (acrocéntricos más pequeños), incluyendo el cromosoma Y.
• Cromosomas Sexuales: X (submetacéntrico) e Y (acrocéntrico pequeño).

Patrón de Bandas G

El patrón de bandas G permite la identificación inequívoca de todos los cromosomas. Un patrón estándar consta de 350-400 bandas, que corresponden a las estructuras observadas en metafase.