Estudio de las Enzimas: Catalizadores Biológicos

Introducción

Catalizador: es un agente capaz de acelerar una reacción química, sin formar parte de los productos finales, ni desgastarse en el proceso.

Enzima: son macromoléculas que actúan como catalizadores biológicos.

Sustrato: son las sustancias sobre las cuales actúan las enzimas.

Centro activo: es la región definida de la enzima que se une al sustrato y donde se cumple la acción catalítica.

Características de las Enzimas

• Aumentan la velocidad de reacción sin consumirse.
• Actúan en condiciones termodinámicamente favorables.
• No afectan el equilibrio de la reacción.
• Son termolábiles.
• Son eficaces en cantidades pequeñas.
• Presentan alta especificidad.
• Están sujetas a controles celulares, genéticos y alostéricos.

Clasificación de las Enzimas

1. Oxidorreductasas: catalizan la transferencia de H o e- de un sustrato a otro. Ej: lactato deshidrogenasa. Ared + Box – Aox + Bred.
2. Transferasas: catalizan la transferencia de un grupo químico (distinto de H) de un sustrato a otro. A-B + C – A + C-B. Ej: glucosa-glucosa 6-fosfato. Glucosinasa.
3. Hidrolasas: catalizan las reacciones de hidrólisis. A-B + H₂O – AH + B-OH. Ej: ureasa. Urea -- CO₂ + 2NH₃.
4. Liasas: catalizan reacciones de ruptura o unión de sustratos. A-B – A + B.
5. Isomerasas: catalizan la interconversión de isómeros. A – B.
6. Ligasas: catalizan la unión de 2 sustratos con hidrólisis simultánea de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP). A + B + ATP – A-B + ADP + Pi.

Cofactores Enzimáticos

Son sustancias no proteicas, termoestables, que pueden encontrarse fuerte o débilmente unidos a la enzima. La mayoría de las enzimas los requieren para su función.

Clasificación de Cofactores

• Coenzimas: son moléculas orgánicas relativamente pequeñas, no proteicas, termoestables y dializables.
• Activadores: pueden ser iones metálicos, mono y divalentes, como el Fe⁺², Mg⁺², Mn⁺², Zn⁺².
• Grupo prostético: cuando se encuentra covalentemente unido a la enzima.

Holoenzima = Apoenzima + Coenzima.
(Enzima total) = (Proteína termolábil) + (No proteínica y termoestable)

Apoenzima: enzima sin coenzima.

Zimógenos, proenzimas, o preenzimas: son proteínas simples que se sintetizan, en las células de origen, al estado de precursores inactivos, que se convierten en enzimas activas por un proceso de hidrólisis. Ej: componentes de los jugos digestivos que son secretados como zimógenos por las glándulas originarias y activados por el pH gástrico.

Determinación de la Actividad Enzimática

La actividad enzimática se determina midiendo la cantidad de producto formado, o sustrato consumido, en un tiempo dado.

Una unidad de cualquier enzima es la cantidad que cataliza la transformación de 1 micromol de sustrato por minuto, bajo condiciones definidas de pH, temperatura, etc.

Factores que Modifican la Actividad Enzimática

Concentración de Enzima

Cuando hay cantidad saturante del mismo, manteniendo constante pH y temperatura, en el medio de reacción, se puede observar una relación lineal entre concentración de enzima y actividad enzimática. Es decir, si sube la concentración de la enzima, también sube su actividad.

Concentración del Sustrato

Cuando la concentración del sustrato es baja, la actividad enzimática crece en forma lineal con la concentración del sustrato, en este sector la curva de reacción es de primer orden. Si va aumentando la concentración del sustrato, se incrementa la velocidad de reacción hasta llegar a una situación en la cual, la actividad no aumenta por más que se eleve la concentración del sustrato. La curva tiende a la horizontal correspondiente a la velocidad máxima. Acá se mantiene constante la concentración de enzima, pH y temperatura.

Temperatura

Si se mantiene constante la concentración de enzima, sustrato y pH, por cada 10 grados de incremento de temperatura, la velocidad de reacción se duplica. La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura óptima. Por encima de esta temperatura, se pierde la actividad catalítica por su desnaturalización. Temperatura óptima: 37°C.

pH

Las enzimas tienen su pH óptimo, a medida que se alejan de este pH, disminuyen su actividad. Ocurre porque algunos restos aminoacídicos de las enzimas tienen cargas y pueden ser responsables tanto de mantener la estructura de la proteína como de interaccionar con el sustrato. El pH del medio puede modificar las cargas de estos aminoácidos y de este modo desnaturalizar a la enzima.

Fundamento del Método de Determinación de la Actividad Diastásica

El sustrato de almidón tamponado se incuba con la muestra, y se produce la hidrólisis enzimática, esta última se determina por el agregado del reactivo yodo por el cual produce coloración con el remanente del almidón no hidrolizado. La disminución del color ocurre en los tubos del desconocido después de incubarlo, respecto del tubo control, es una medida de la actividad diastasa de la muestra (UD).

• Sustrato: almidón
• Muestra: miel
• pH: 5,3
• Temperatura: 37°C constante

Preparación de la Muestra

1. Pesar 2 gr de miel, añadir 1 ml de buffer pH 5,3 y mezclar.
2. En 10 tubos agregar 1 ml de NaCl al 1%.
3. Agregar al tubo uno 1 ml de la muestra, mezclar por aspiración y expulsar con una pipeta.
4. Pasar 1 ml del tubo uno al dos, mezclar y continuar así hasta el nueve, desechar el último ml.
5. Tubo diez de testigo.
6. Colocar a cada tubo 1 ml de solución de almidón e incubar 30 min a 37°C.
7. Retirar, enfriar y poner 4 gotas de solución de trabajo de yodo a cada tubo y agitar, observar coloración.

Cálculos

UD x 2. Valores normales entre 32 y 128 UD.