Exploración de la Hemostasia: Pruebas Clave y Procedimientos

Generalidades sobre las Pruebas de Hemostasia

1. Toma de Muestra

1.1. Preparación del Paciente

El paciente debe estar en ayunas, al menos no haber ingerido alimentos grasos en las horas previas a la extracción, ya que estos dan lugar a plasmas lipémicos, que pueden plantear problemas a la hora de la detección fotométrica del coágulo. Lo más adecuado es que el enfermo no haya tomado ninguna medicación durante, por lo menos, 2 semanas previas al análisis, pero hay que investigar igualmente y anotar la toma de aspirina, heparina, anticoagulantes orales y otros fármacos que potencian o reducen el efecto de estos. Hay que tener en cuenta los siguientes fármacos que potencian el efecto de los anticoagulantes orales: antiinflamatorios, antibióticos y sulfamidas que atacan la flora intestinal, etc.

1.2. Extracción de la Muestra

La extracción sanguínea tiene que realizarse con el menor éntasis circulatorio posible, colocando el compresor poco apretado y manteniéndolo el tiempo necesario. Durante la punción venosa, para no contaminar la sangre con tromboplastina tisular que puede activar la coagulación, se ha de causar un daño mínimo a los tejidos circundantes. Se rechazan los primeros mililitros de sangre extraídos porque estos pueden contener restos de tromboplastina tisular. Lo mejor para ello es el uso de un sistema de extracción múltiple que incluye tubos con vacío interno (vacutainer). No insertar primero en la aguja extractora el tubo destinado a la recogida de sangre para pruebas de hemostasia. No se debe tomar sangre de una vía venosa colocada previamente, pues esta puede contener restos de heparina que contaminen la muestra.

1.3. Anticoagulación de la Muestra

Citrato sódico al 3,8% 1/10 -> Conserva mejor los factores de coagulación -> Citrato trisódico Na3C6H5O7, empleada en la hemostasia primaria. La mezcla entre la muestra y anticoagulante debe realizarse inmediatamente después de la extracción de sangre y con un movimiento de suave inversión para evitar la formación de espuma y la rotura de hematíes, que son ricos en tromboplastina tisular. Generalmente en hemostasia se mezcla 1 parte con solución citrato sódico y 9 partes de sangre venosa, pero en situaciones de anemia esta proporción puede ser modificada ya que el hematocrito es menor.

1.4. Procesamiento de la Muestra

Al procesar la muestra se pretende conseguir unos plasmas que contengan una apreciable cantidad de casi todos los factores. El único factor que está ausente en estos tipos de plasmas es el Ca++ debido a la acción quelante del citrato.

1.4.1. Obtención de Plasma Rico en Plaquetas (PRP)

Se logra mediante una centrifugación suave, unas 1000 rpm de la muestra durante 10 min. Tras la centrifugación el sobrenadante (PRP) se retira rápidamente del resto y se transfiere a un tubo adecuado. Se suele emplear para estudios plaquetarios.

1.4.2. Obtención de Plasma Pobre en Plaquetas (PPP)

Se consigue mediante una centrifugación intensa de la muestra, a unas 3000 rpm durante 10 min. Tras la centrifugación el sobrenadante, PPP, se retira del resto y se transfiere a un tubo adecuado. Suele ser el utilizado en la mayoría de las pruebas de coagulación.

1.4.4. Obtención de Suero

La manera correcta de obtener suero es la que se expone a continuación:

• Dejar que la sangre extraída, no anticoagulada y depositada en un tubo de centrifugación de vidrio o en un tubo especial (tubos de los sistemas vacutainer) se coagule. Para ello, tras tapar el tubo, se puede hacer una de las siguientes maniobras:
  • Dejar la sangre a temperatura ambiente, durante un periodo de tiempo comprendido entre los 30 y los 120 min.
  • Incubar la sangre en un baño de agua a 37ºC durante 20 a 30 min. Esto favorece su coagulación y hace que esta se produzca más rápidamente.
• Desprender suavemente el coágulo formado, de las paredes del tubo, con un tubo capilar o una pipeta Pasteur.
• Centrifugar la sangre coagulada a 3000 rpm durante 10 min.
• Decantar el sobrenadante (suero) con una pipeta Pasteur. Esto se ve facilitado en los tubos de los sistemas vacutainer por la presencia de un gel de silicona ya que este forma una interfase entre el suero y la fracción forme de la sangre.

Si se pretende obtener suero a partir de sangre de enfermos heparinizados, esta se coagula añadiendo 0,2 ml de reptilase por cada 2 ml de sangre total. El suero en hemostasia solamente se usa en alguna de las pruebas mezcladas, en la determinación de ATIII y de PDF.

1.5. Conservación de la Muestra

La sangre anticoagulada debe ser procesada lo antes posible y, en cualquier caso, en un plazo inferior a 30 min contados desde la extracción de la misma. Si el procesamiento de la muestra se retrasa, esta ha de conservarse a unos 5ºC para evitar la pérdida de algunos factores. El plasma conseguido a partir de la muestra, tiene que ser utilizado antes del fin de las 4 primeras horas que siguen a la extracción. Si esto no es posible, el plasma puede conservarse durante 12 h, refrigerándolo a +5º, durante 1 mes, sometiéndolo a un proceso de congelación rápida, mediante su exposición a una temperatura de -20ºC.

Pruebas que Investigan la Hemostasia Primaria

1. Pruebas que Estudian la Fragilidad Vascular

1.1. Prueba de Rumpel-Leede

Esta prueba consiste en evaluar la resistencia que ofrecen las paredes capilares al aumento de la presión intercapilar y a la anoxia. Para ello se aplica un torniquete en el brazo, durante un tiempo determinado, lo que origina un incremento en la presión intercapilar y una anoxia, que son los responsables de la posible producción de extravasaciones sanguíneas, visibles en forma de petequias. Se considera que la prueba es positiva (aumento de fragilidad capilar) cuando aparecen más de 10 petequias, en la cara anterior del antebrazo. Se constata un ascenso de la fragilidad capilar en las trombocitopenias, en la enfermedad de Willebrand, en el escorbuto, y sobre todo en las púrpuras vasculares.

2. Pruebas que Estudian la Funcionalidad Plaquetaria

2.1. Pruebas de Adherencia Plaquetaria

Estas pruebas se basan en la valoración de la adherencia de las plaquetas al vidrio. Una forma de llevar a cabo esta valoración consiste en comparar el recuento plaquetario determinado en una muestra de sangre, obtenida normalmente, con el determinado en otra muestra del mismo paciente, que al ser recogida, atraviesa una columna que contiene bolitas de vidrio. El resultado se indica en porcentaje de plaquetas retenidas. El % normal de plaquetas retenidas debe ser establecido por cada uno de los laboratorios que realiza alguna de estas pruebas, pero oscila aproximadamente entre el 25 y 60%. La adherencia plaquetaria disminuye en la enfermedad de von Willebrand y en el síndrome de Bernard-Soulier, y aumenta en el tromboembolismo pulmonar, en las enfermedades coronarias, en la diabetes mellitus y en los estados postoperatorios. Estas pruebas son complejas y poco reproducibles por lo que solo suelen hacerse en laboratorios especializados.

2.6. Tiempo de Hemorragia o Sangría (TS)

Tiempo que transcurre desde la sección de un grupo de capilares hasta la formación del tapón plaquetario. Se determina efectuando una pequeña herida en la piel, y midiendo el tiempo que tarda en cesar de manar sangre a través de esa herida. La herida puede consistir en una punción con una lanceta en el lóbulo de la oreja, si se utiliza la técnica de Duke, o en un par de cortes realizados en el antebrazo y con un aparato especial, si se emplea la técnica de Ivy, que es más exacta que la de Duke. El tiempo de hemorragia normal con la Duke es de 3 minutos, y con Ivy 6. El tiempo de hemorragia indica la capacidad constrictora de los capilares y el nº y aptitud adherente y agregante de las plaquetas. Este tiempo está alargado en las trombocitopenias, trombopatías congénitas, enfermedad de von Willebrand y sujetos que han tomado aspirina.

Recuento de plaquetas.

Pruebas que Investigan la Coagulación

1. Pruebas que Estudian Globalmente la Coagulación

1.1. Tiempo de Coagulación

Tiempo que tarda en generarse un coágulo en una muestra de sangre no anticoagulada que se pone en contacto con una superficie de vidrio. Para determinar esto, se sitúa la muestra en el interior de un tubo de vidrio y se incuba a 37ºC, siendo el tiempo de coagulación el transcurrido desde el depósito de la sangre en el tubo hasta la aparición de un coágulo en el interior de este. El tiempo de coagulación depende de numerosas variables, por ejemplo, el volumen de la muestra que se analiza y la superficie del tubo que entra en contacto con la sangre, por lo que para que su determinación sea reproducible, la técnica empleada ha de estar perfectamente estandarizada. En cualquier caso, sus valores normales suelen estar comprendidos entre los 5 y los 10 min. El estudio del tiempo de coagulación permite la detección de trastornos relacionados con la vía intrínseca y la común de la coagulación. Se encuentra alargamiento de estos factores en déficits de factores de la vía intrínseca, por ejemplo, la hemofilia, en situaciones de afibrinogenemia, y de fibrinolisis excesiva y en terapias con heparina, que por esto, esta prueba se puede utilizar en el control de los tratamientos heparínicos. Esta prueba es poco sensible, ya que no detecta déficits ligeros de factores, por lo que está en desuso.

1.2. Tiempo de Recalcificación del Plasma

Tiempo que tarda en coagularse un plasma, obtenido a partir de una muestra de sangre anticoagulada con citrato, cuando se vuelve a recalcificar. Por eso se vierte el plasma en un tubo de vidrio, se le añade una solución de cloruro cálcico (CaCl2) y se incuba la mezcla a 37ºC, siendo el tiempo de recalcificación del plasma el transcurrido desde la adición del CaCl2 al plasma hasta la coagulación de este. El plasma empleado puede ser pobre en plaquetas. Si es un PRP esta prueba se conoce como test de Howell. Mientras que el tiempo de recalcificación del PPP está comprendido entre 90 y 250 segundos, el test de Howell está entre 90 y 130. La utilidad y la interpretación clínica de esta prueba son similares a las del tiempo de coagulación y su única ventaja con respecto a este, consiste en que no se precisa realizarlo inmediatamente tras la extracción de la muestra.

2. Pruebas que Estudian la Vía Intrínseca

2.1. Tiempo de Tromboplastina Parcial (TTP)

O tiempo de cefalina. Tiempo que se necesita para que se coagule un PPP, tras su recalcificación y en presencia de un sustituto del F3p. La recalcificación del PPP se realiza mediante la adición de una solución de cloruro cálcico (CaCl2). El sustituto del f3p consiste en una suspensión de fosfolípidos, obtenida a partir de cerebros de conejos que recibe el nombre de cefalina. La adición de cefalina evita que el tiempo que tarda en generarse el coágulo de fibrina dependa del nº de plaquetas que están presentes en el plasma. Los valores normales son 60-100 segundos.

2.2. Tiempo de Tromboplastina Parcial Activada (TTPA)

Su técnica de determinación es casi igual que la del TTP, pero incorpora una sustancia activadora de los factores de contacto, debido a lo cual esta prueba es más rápida que la anterior. Como activador de los factores de contacto se pueden utilizar varias sustancias entre las que cabe destacar el caolín, el polvo de vidrio, la sílice (celite) y el ácido elágico. Los valores normales del TTPA comprendido habitualmente entre 30-40 segundos. También se puede expresar el resultado en forma de relación o cociente entre el nº de segundos que tarda en coagular el plasma del paciente y el nº de segundos que tarda en coagular 1 plasma control normal. Cuanto más alto es este cociente, mayor es el déficit coagulatorio. Tanto TTP como TTPA sirven para explorar el estado de la vía intrínseca, y también de la vía común de la coagulación. El TTP y TTPA se emplean para detectar déficits de los factores de la vía intrínseca de la coagulación y para el control de los tratamientos con anticoagulantes y en concreto de las terapias con heparina.

3. Pruebas que Estudian la Vía Extrínseca

3.1. Tiempo de Protrombina (TP)

Tiempo de Quick. Tiempo que tarda en coagular un PPP, cuando se pone en contacto con un exceso de calcio y de tromboplastina hística. La tromboplastina tisular se prepara a base de extractos de cerebro o de pulmón de hombre o de animales, generalmente conejo o vaca. Las tromboplastinas hísticas fabricadas por los distintos laboratorios comerciales no suelen tener la misma sensibilidad, unas son más activas que otras. Debido a ello algunos organismos internacionales han propiciado la elaboración de una TH que sirve de referencia internacional, patrón primario de TH por lo que la sensibilidad de todas las TH comerciales ha de ser comparada con la de la TH de referencia internacional. Esta comparación se expresa en forma de un índice de sensibilidad internacional (ISI). Habitualmente el reactivo utilizado en esta prueba es una mezcla de TH y de calcio y por ello recibe el nombre de tromboplastina cálcica. Valores TP comprendidos entre 11 y 15 seg. El porcentaje de la actividad de la protrombina de un plasma normal oscila habitualmente entre 70 y el 100%. Además, los resultados pueden expresarse en forma de proporción, ratio, entre el valor, en segundos, del TP del plasma problema y el del plasma control normal no diluido. Además, generalmente cuando se pretende hacer un control de anticoagulación se calcula el cociente corregido con el ISI con el fin de evitar el error que implica el uso de diferentes TH. Este cociente corregido permite relacionar los resultados obtenidos con distintos reactivos comerciales, recibe el nombre de INR y se calcula -> INR= (TP del plasma del paciente / TP plasma control normal) ^ ISI. El INR de protrombina normal para pacientes sin anticoagulación es entre 0,9 y 1,15. Como regla general para un tratamiento con anticoagulantes orales, antivitamina K o dicumarinas, el INR debe fluctuar entre los valores de 1,5 y 4,5, de forma que si es menor que 1,5 el paciente está escasamente anticoagulado, y si es mayor que 4,5 el enfermo está excesivamente anticoagulado. El TP sirve para explorar el estado de la vía común, y sobre todo de la vía extrínseca de la coagulación. Así pues, suele emplearse para la detección de déficits de factores de la vía extrínseca, para el control de pacientes sometidos a terapias con dicumarinas y para la vigilancia de la evolución de enfermos con algunos trastornos hepáticos.

4. Pruebas que Estudian la Vía Común

4.1. Tiempo de Trombina (TT)

Tiempo que tarda en coagular un PPP, cuando se le añade una pequeña cantidad de trombina. Los valores del TT oscilan entre los 15 y 20 seg. Habitualmente junto con la determinación del TT del plasma problema, también se realiza la de un plasma control normal. Se considera significativamente patológica una diferencia entre ambos TT de 4 o + segundos. El TT está alargado cuando en el plasma hay exceso de inhibidores de la trombina y cuando el fibrinógeno está alterado. Las sustancias que normalmente inhiben la trombina son la heparina y los PDF.

4.2. Tiempo de Reptilase (TR)

Se determina de una forma muy parecida a la del tiempo de trombina, pero la trombina se sustituye por veneno de la serpiente Bothrops atrox. Este veneno realiza la misma acción que la trombina. Sin embargo, la acción de este veneno no es inhibida por la heparina. Los valores normales del TR están comprendidos entre los 15 y los 20 segundos. Esta prueba se emplea para diferenciar entre una alteración del fibrinógeno y un efecto de la heparina. Si el tiempo de trombina y reptilase están alargados, el enfermo padece alteración del fibrinógeno, si trombina alargado y reptilase normal, paciente bajo efectos de heparina.

7. Pruebas de Control del Tratamiento Anticoagulante

Los 2 tipos de anticoagulantes que tienen una acción in vivo y por tanto pueden ser utilizados en tratamiento anticoagulantes son la heparina y las dicumarinas (anticoagulantes orales o antivitaminas K). La heparina es administrada endovenosamente o por vía subcutánea, y tiene un efecto inhibitorio inmediato de la coagulación. Las pruebas que sirven para controlar la actividad de la heparina circulante son: tiempo de coagulación, test de Howell, tiempo de protrombina y TTPA. Suele emplearse TTPA para realizar este control. Se considera que el tratamiento anticoagulante con heparina es correcto cuando la relación entre el TTPA del plasma problema y el de 1 plasma control normal está comprendido entre 1,5 y 2. Las dicumarinas se administran por vía oral y tardan de 12 a 24 h en ejercer un efecto anticoagulante. La terapia con dicumarinas suele controlarse con la determinación del tiempo de protrombina, pero hay que tener presente que este tiempo no valora la actividad del factor IX. Se considera que la terapia con dicumarinas es correcta cuando:

• El TP está alargado.
• Porcentaje de actividad de la protrombina oscila entre el 20 y 35%.
• INR fluctúa entre 1,5 y 4,5.