Extracción y Cuantificación de Proteínas: Homogenización Tisular y Ensayo Bradford

Introducción a la Extracción de Proteínas

Los tejidos son ricos en proteínas que cumplen diferentes funciones y, por lo tanto, poseen diferentes características. Según estas características, es posible solubilizarlas, separarlas y purificarlas mediante diversos métodos.

Homogenización de Tejidos y Células

El primer paso en la extracción de la mayoría de las proteínas y estructuras subcelulares es la rotura de los tejidos o de las células para obtener un lisado celular en el que la proteína, el complejo multiproteico o la estructura subcelular se encuentre en condiciones que permitan su aislamiento. Esto se consigue empleando procedimientos mecánicos suaves conocidos generalmente como homogenización. Estos métodos producen la rotura suave de las membranas celulares, con lo que se libera el contenido celular. Entre los métodos comunes se encuentran:

• Shock osmótico
• Mortero (fricción)
• Sonicación

Solubilización de Proteínas

Las proteínas obtenidas deben ser solubilizadas en buffers que pueden ayudar a extraerlas de las células y, además, mantenerlas para su posterior utilización.

Objetivo del Estudio

El objetivo de este práctico es realizar un protocolo para la homogenización de tejido y la obtención de proteínas totales, para su posterior cuantificación y caracterización.

Cuantificación de Proteínas: El Método de Bradford

Una de las operaciones más frecuentes utilizadas en los laboratorios de investigación es la determinación de la concentración total de proteínas presentes en una preparación. El método de Bradford es muy utilizado para una determinación rápida y exacta de proteínas totales de fracciones celulares, y en la determinación de concentración de proteínas para su utilización en geles de electroforesis.

Principios del Ensayo de Bradford

El ensayo estándar posee una sensibilidad desde 0,1 hasta 1,4 mg/mL de proteínas. El ensayo se basa en la observación del cambio de absorbancia máxima de la solución ácida Azul de Coomassie Brillante, que varía de 465 a 595 nm cuando ocurre la unión con la proteína. Esta unión se debe a la estabilización de la forma aniónica del colorante mediante interacciones hidrofóbicas e iónicas, causando un cambio visible de color.

El colorante posee una gran cantidad de grupos apolares, pero tiene 2 grupos polares (SO₃⁻²) que se unen a cargas positivas de las cadenas laterales de aminoácidos que poseen argininas o lisinas, siendo esta especificidad una desventaja para el método.

Curva de Calibración y Proteína Patrón

Este ensayo requiere, además, la realización de una curva de calibración para la determinación de la concentración de proteínas de una muestra, utilizándose comúnmente BSA (albúmina sérica bovina) como proteína patrón.