Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos: Guía completa

Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos

1. Pretratamiento de la Muestra

El pretratamiento de la muestra es crucial para obtener suspensiones celulares adecuadas. Se realiza de diferentes maneras según el tipo de muestra:

• Sangre: Los ácidos nucleicos se obtienen a partir de leucocitos. La sangre no debe contener heparina ni citrato sódico, sino EDTA. La lisis de los hematíes se realiza con NH₄Cl o Tritón-X.
• Cultivos celulares: El pretratamiento consiste en la recolección de células, que puede ser de cultivos en suspensión o en monocapa.
• Tejidos animales o vegetales frescos: Se realiza una homogeneización, que puede ser:
  • Mecánica: Somete al tejido a una acción abrasiva o trituradora, pudiendo ser automatizada o manual con mortero.
  • Química: Somete al tejido a la acción de proteasas y detergentes que degradan componentes tisulares.
• Tejidos fijados en formol e incluidos en parafina (FFPE): Se realiza una desparafinación.
• Esputo: Se fluidifica con un agente mucolítico como la N-acetil-L-cisteína.

2. Extracción de Ácidos Nucleicos

La extracción implica dos procesos: lisis celular e inactivación de nucleasas. Se incuba la suspensión en una solución de lisis que puede incluir:

• Detergentes: Desestructuran la bicapa lipídica (SDS, SDS+EDTA, Tritón X-100 o Tween 20).
• EDTA: Inhibe la acción de ADNasas.
• Proteasas: Útil en FFPE (Proteinasa K).
• Agentes caotrópicos: Inactivan nucleasas (Isotiocianato de guanidinio).

Para células con pared, se usan tratamientos enzimáticos (lisozima o liticasa), mecánicos (ebullición, sonicación) o con CTAB (facilita la eliminación de polisacáridos y polifenoles).

Para purificar solo ADN, el ARN se elimina con ARNasa A, incubando a 37°C durante 15-45 minutos.

3. Purificación de Ácidos Nucleicos

Consiste en separar los ácidos nucleicos de los demás componentes del lisado. Las técnicas son:

• Con solventes orgánicos: Se basa en la diferente solubilidad de los componentes del lisado en solventes orgánicos (fenol+cloroformo+alcohol isoamílico).
• Salting-out: Precipita proteínas en altas concentraciones salinas, disminuyendo su solubilidad.
• Cromatografía de intercambio iónico: Se basa en la unión electrostática reversible de la molécula diana con un grupo funcional de la matriz, eluyendo los ácidos nucleicos con tampones salinos.
• Cromatografía de adsorción: Se basa en la capacidad de adsorción de los ácidos nucleicos al vidrio y sílice en presencia de sales caotrópicas.
• Con esferas magnéticas: Unión de los ácidos nucleicos a microesferas magnéticas retenidas mediante un imán (por adsorción o separación magnética por afinidad).
• Ultrafiltración: Retención por tamaño de las moléculas de ácidos nucleicos mediante membranas con un tamaño de poro determinado.
• De plásmidos: Se usan como vectores para clonar secuencias génicas, separándolos del ADN cromosómico y ARN bacteriano.

4. Calidad de los Ácidos Nucleicos

Se determina por:

1. Integridad: Determina si un ácido nucleico conserva su tamaño original.
2. Pureza: Determina la ausencia de contaminantes (cocientes 260/280, 260/230 y 320).