Fases Clave en las Técnicas de Hibridación Molecular

Las diferentes técnicas de hibridación, de forma genérica, se pueden dividir en 4 fases:

1. Preparación de la Muestra y Soporte (Prehibridación)

En esta fase se preparan la muestra y el soporte. Dependiendo de la técnica a realizar, se pueden desarrollar esta fase en múltiples pasos, incluyendo digestiones enzimáticas, electroforesis, bloques de uniones inespecíficas, etc.

2. Hibridación

Se producirá el híbrido sonda/secuencia diana, teniendo en cuenta:

• Tm del híbrido que sea óptima: dependiente del ADN o ARN utilizado.
• Creación de mismatch o híbridos imperfectos: que tienen T_m cercanas a la óptima. Normalmente, este mismatch es un 15% dentro de una molécula de ácido nucleico, pero para evitarlo habrá que definir el tiempo de esta incubación para asegurarse una buena hibridación, que dependerá de la concentración de la sonda y que, según las diferentes técnicas, puede oscilar entre 30 minutos o 24 horas.
• Condiciones relajadas: facilitando con ello la formación y la estabilidad del híbrido sonda/secuencia diana. Estas condiciones relajadas son alta concentración de cationes monovalentes y baja concentración de formamida.

3. Lavado de Poshibridación

Se considera muy importante, ya que en ella se trata de mantener los híbridos sonda/secuencia diana y eliminar aquellos híbridos imperfectos con secuencias parecidas a la diana. De esta fase dependerá la especificidad de la técnica utilizada. El lavado se realizará con un tampón en el cual se establecerán las condiciones de rigurosidad, mediante la combinación de la temperatura de lavado, fuerza iónica y la concentración de formamida. Normalmente, se trabajan con condiciones elevadas de rigurosidad en este lavado, permitiendo que solo se mantengan estables los híbridos sin mismatch o con bajos porcentajes de ello. Se eleva la temperatura del lavado y se usa un tampón con baja concentración salina o con alta concentración de formamida.

4. Detección del Híbrido

Variará según cuál sea el tipo de marcador utilizado, utilizando diferentes métodos:

• Marcaje radiactivo: se usa en técnicas de hibridación sobre soporte. La detección se realiza por autorradiografías, colocando una placa de rayos X sobre el soporte para que se impresione en ella la emisión radiactiva de la sonda. Tras el revelo de la placa, si ha habido hibridación, se observan marcas oscuras.
• Fluorocromos: se emplean normalmente para las hibridaciones in situ. Por lo que su detección será a través del microscopio de fluorescencia, donde, al ser excitados con una longitud de onda adecuada, los fluorocromos emitirán fluorescencia que permite su visualización.
• Haptenos: se usarán en todo tipo de técnicas. Al ser los haptenos antigénicos, la detección se realiza por métodos inmunohistoquímicos con un anticuerpo antihapteno marcado con un fluorocromo o una enzima, que cataliza una reacción en la cual se produce un producto coloreado. En el caso de la biotina, en la detección, en vez de un anticuerpo, se puede utilizar la estreptavidina marcada.