Que función tienen las proteínas integradoras en la membrana celular

7.1 DOT-ELISA O método de las manchas. Es un Método sencillo que permite fijar gran cantidad de proteínas a las membranas de Nitrocelulosa. Se siembra Sobre la membrana de nitrocelulosa unas gotas de la solución antigénica de Forma que el área de  detección se limite a un área de un diámetroaproximado de 1mm. Para detectar Ac en suero Se sigue el siguiente procedimiento:

1.Depositar sobre la membrana de nitrocelulosa una pequeña gota de Ag Y dejar secar bajo una lámpara.

2.Bloquear la membrana con proteína irrelevante y lavado.

3.Sumergir la membrana en una solución de la muestra problema Sospechosa de contener Ac. Incubar, eliminar la solución y lavar la membrana.

4.Sumergir la membrana en una solución de Ac marcado con enzima. Incubar, eliminar la solución y lavar la membrana.

5.Sumergir la membrana en una solución de sustrato que de un Producto final coloreado que precipite en la membrana sobre el lugar de Reacción.

6.Recuperar la membrana y realizar la lectura. Si en la muestra Había Ac en la zona de sembrado del Ag se observa una coloración.

7.2  Western Blot. Consiste en La combinación de tres técnicas analíticas:Separación mediante electroforesis de los componentes Del Ag en geles de poliacrilamida. Electrotransferencia o electroblotting de los Componentes del Ag desde los geles a membranas inmovilizantes. Identificación principalmente mediante enzimoinmunoensayos Con Ac conocidos.

Esta Técnica se desarrolla en seis pasos:

1.Solubilizacion del Ag: con ella se consigue La ruptura del Ag en componentes polipeptídicas de distintos pesos Moleculares que contienen los epitopos del Ag y los mantienen activos.Ademas Provoca un reparto uniforme de las cargas lo que hace que al someterlos A un campo eléctrico migren únicamente en función del peso molecular de los Peptidos.

2.Preparación de los geles de poliacrilamida: estos geles están Formados por monómeros de acrilamida y bisacrilamida.

3.Separación electroforetica del Ag en  el gel: una vez preparado el Gel, se realizaran unos pocillos y se aplicara la muestra. Se rellenara la Cubeta de electroforesis con el tampón adecuado y se aplicara el campo Eléctrico para que migren los distintos componentes del Ag.

4.Electrotransferenciadel Ag a un soporte de membrana.Se suele utilizar Membranas de nitrocelulosa.

· En primer lugar se mantiene el gel en un tampón Durante unos 30 minutos.

·A continuación, se coloca todo el sistema en una cubeta con Tampón en este orden: esponja, papel de filtro, gel, membrana, papel de Filtro y esponja y se deja pasar la corriente desde el polo negativo al Positivo.

·Se suele incorporar al gel un control de la transferencia Para comprobar que la transferencia se ha realizado adecuadamente.

·Se introduce en la cubeta de electroforesis 1h a 100V, utilizando Un refrigerante para que no suba mucho la temperatura.

·5. Bloqueo de los sitios de uníón de proteínas libres en la Membrana.

·6. Enzimoinmunoensayo o radioinmunoensayo: para detectar Ac en muestras de suero problema o  para identificar bandas antigénicas Específicas con antisueros conocidos. Se suele utilizar para revelado anti-IgG Marcado con enzima.