Fundamentos y Aplicaciones de la Cromatografía y Electroforesis
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Fundamentos de la Cromatografía
La cromatografía es una técnica de separación que se basa en la diferente afinidad de los solutos por dos fases mutuamente inmiscibles.
- En una cromatografía, un soluto con polaridad diferente a la fase estacionaria o poca afinidad a la misma, en la evolución avanzará de manera más rápida.
- Si la fase estacionaria es menos polar que la fase móvil, hablamos de una cromatografía de fase inversa o reversa.
- Cuando los diferentes componentes de una muestra, luego de ser eluidos en una cromatografía, son recuperados para un uso posterior, nos referimos a una cromatografía de tipo preparativa.
Fenómenos de Separación Cromatográfica con la Fase Estacionaria
- Intercambio iónico: Resinas
- Exclusión o permeación en gel: Sephadex
- Adsorción: Alúmina
- Partición: Líquidos enlazados a sílica gel
Conceptos Clave en Cromatografía
- Una serie eluotrópica agrupa u ordena a los solventes de acuerdo con su constante dieléctrica.
- Una altura de plato teórico (AEPT) pequeña nos genera una columna más eficiente.
- En la cromatografía de partición, los solutos se reparten entre dos líquidos.
- En función de su fuerza, las resinas de intercambio iónico se clasifican en catiónicas fuertes y débiles, y aniónicas fuertes y débiles.
- El ion Be2+ se retendrá más fuertemente en una resina de intercambio iónico.
Aplicaciones de la Cromatografía de Exclusión
- Purificación de polímeros
- Eliminación de sales y aminoácidos
La exclusión por gel es una técnica cromatográfica no interactiva basada en el tamaño y la forma de los solutos.
Cromatografía de Afinidad
Sustancias que pueden ligar para separar sustancias en una cromatografía de afinidad:
- Anticuerpos e inhibidores enzimáticos
Cromatografía de Gases
Características que deben cumplir las fases estacionarias utilizadas en cromatografía de gases:
- Baja volatilidad
- Estabilidad térmica
- Químicamente inertes
El hidrógeno es un gas acarreador (fase móvil) utilizado en cromatografía de gases. Falso, deben ser inertes como N2 o Ar.
HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Eficacia)
Tipo de analitos elegibles para ser analizados por HPLC:
- No volátiles
- Termolábiles
Un detector común utilizado en HPLC es un espectrofotómetro de UV-VIS.
Electroforesis
La electroforesis es una técnica utilizada para separar moléculas por su migración en un campo eléctrico.
- El papel es un soporte utilizado en electroforesis en el que los analitos se desplazan sobre la superficie.
- El papel del pH mediante el uso de amortiguadores en electroforesis es para que las biomoléculas pasen a formas más cargadas.
- En la electroforesis vertical se utilizan principalmente geles de poliacrilamida.
SDS-PAGE
En la técnica SDS-PAGE, la ruptura de los puentes disulfuro para separar las subunidades proteicas se realiza utilizando β-mercaptoetanol.