Fundamentos y Aplicaciones de la Electroforesis: Principios, Técnicas y Fenómenos Clave

Cuestionario sobre Electroforesis

1. ¿Es la electroforesis una técnica electrolítica?

2. ¿En qué se basa la separación de especies por electroforesis?

3. ¿La electroforesis es una técnica cromatográfica?

4. Señale brevemente los fenómenos de transporte que pueden estar presentes en la electroforesis y las formas de minimizar aquellos que sean no deseados.

5. Defina movilidad iónica y describa las expresiones matemáticas que relacionan este parámetro con los parámetros electroforéticos.

6. Señale la influencia del pH en la movilidad electroforética.

7. Describa el fenómeno electroosmótico, su importancia en la separación de especies y las expresiones que lo definen.

8. Explique brevemente el fundamento de las siguientes técnicas electroforéticas convencionales: isotacoforesis, enfoque isoeléctrico, inmunoelectroforesis y técnicas de blotting.

9. Tipos de soportes en electroforesis de zona.

10. Parámetros característicos en la preparación de un gel en la técnica SDS-PAGE.

11. ¿Qué diferencia resolutiva se pone de manifiesto en la técnica PAGE en condiciones nativas y desnaturalizantes?

12. Modos de introducción de muestra en electroforesis capilar.

Respuestas Detalladas

1. ¿Es la electroforesis una técnica electrolítica?

No, la electroforesis no se trata de una técnica electroanalítica en el sentido estricto de la electrólisis. En la electroforesis, la migración de las especies electroactivas ocurre en el medio electroforético, pero la corriente se interrumpe antes de que los analitos lleguen a los electrodos, evitando reacciones electroquímicas en su superficie.

2. ¿En qué se basa la separación de especies por electroforesis?

La separación en electroforesis se basa en la migración diferencial de especies cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico. Las especies con carga positiva (+) se dirigen hacia el cátodo, mientras que las especies con carga negativa (-) se dirigen hacia el ánodo. La separación de especies que se dirigen hacia un mismo electrodo se fundamenta principalmente en su relación carga/masa (o más precisamente, carga/radio hidrodinámico, que influye en la fricción). A mayor relación carga/masa, mayor movilidad electroforética.

3. ¿La electroforesis es una técnica cromatográfica?

No, la electroforesis no es una técnica cromatográfica, aunque comparte algunas similitudes superficiales. En ambas, se obtienen "picos" que corresponden a cada soluto en un electroferograma (en electroforesis) o un cromatograma (en cromatografía). Sin embargo, la causa fundamental de la separación de los solutos es distinta:

• En cromatografía, la separación se basa en la partición diferencial entre una fase estacionaria y una fase móvil.
• En electroforesis, la separación se basa en la movilidad diferencial de especies cargadas en un campo eléctrico.

No obstante, existe una técnica híbrida conocida como electrocromatografía capilar (CEC), que combina principios de ambas.

4. Fenómenos de Transporte en Electroforesis y su Minimización

En la electroforesis, pueden estar presentes varios fenómenos de transporte que afectan la resolución de la separación:

• Migración Electroforética: Es el movimiento de especies cargadas debido a la aplicación de un potencial eléctrico y su intensidad. Es el fenómeno deseado para la separación.
• Difusión: Es el movimiento de especies debido a un gradiente de concentración. Se genera cuando las especies se separan, favoreciendo el transporte desde zonas de mayor concentración hacia zonas de menor concentración. Está regida por el coeficiente de difusión molecular o iónico. La difusión es un fenómeno no deseado que causa ensanchamiento de las bandas.
• Convección: Es el transporte de todo tipo de especies causado por un movimiento global de la disolución (flujo de masa) al aplicar un potencial. Puede ser inducida por gradientes de temperatura (calentamiento Joule) o por el fenómeno electroosmótico. La convección es un fenómeno no deseado que reduce la resolución.

Minimización de Fenómenos No Deseados:

• Para la Difusión: Se minimiza utilizando geles con porosidad controlada que restringen el movimiento, o trabajando con tiempos de separación más cortos.
• Para la Convección (por calentamiento Joule): Se minimiza disipando eficientemente el calor generado (por ejemplo, mediante capilares de pequeño diámetro o sistemas de refrigeración), utilizando tampones de baja conductividad, o aplicando voltajes más bajos.

5. Movilidad Iónica y su Relación con Parámetros Electroforéticos

La movilidad iónica (o movilidad electroforética) es la velocidad que adquiere una especie cargada en un campo eléctrico determinado, normalizada por la intensidad de dicho campo. Se define por la relación entre la carga de la especie y su radio hidrodinámico (que influye en la fricción que experimenta al moverse a través del medio).

• Carga: La naturaleza de la carga (positiva o negativa) determina la dirección del desplazamiento (hacia el cátodo o el ánodo). La magnitud de la carga influye directamente en la fuerza eléctrica experimentada.
• Radio Iónico (o Radio Hidrodinámico): Depende del tamaño y la forma de la molécula, y de su interacción con el disolvente. A mayor tamaño, mayor fricción y, por lo tanto, menor movilidad.

En general:

• A igual tamaño, una mayor carga neta resulta en una mayor velocidad y, por ende, mayor movilidad.
• A igual carga, un menor tamaño (menor radio hidrodinámico) resulta en una mayor movilidad.

Las expresiones matemáticas que relacionan la movilidad electroforética (μ) con los parámetros electroforéticos son:

• Velocidad de migración (v): `v = μE`, donde `E` es la intensidad del campo eléctrico.
• Movilidad electroforética (μ): `μ = (q / 6πηr)`, donde `q` es la carga neta del ion, `η` es la viscosidad del medio, y `r` es el radio hidrodinámico del ion.

6. Influencia del pH en la Movilidad Electroforética

El pH del medio es un factor crítico que puede alterar significativamente la carga neta de las especies anfolíticas (como proteínas o péptidos) y, por consiguiente, su movilidad electroforética. Para una separación electroforética óptima, es fundamental conocer las cargas netas de los analitos en función del pH del medio tamponado.

Las especies anfolíticas poseen grupos ionizables que pueden ganar o perder protones dependiendo del pH. Si el pH del medio es mayor o menor que el punto isoeléctrico (pI) de un analito, este mostrará diferentes grados de ionización y, por lo tanto, diferentes cargas netas. Estas diferencias en la carga neta se traducen directamente en diferencias en la movilidad, permitiendo la separación de analitos que de otro modo serían difíciles de resolver.