Fundamentos y Aplicaciones de la Electroforesis de Proteínas

Definición de Electroforesis

La electroforesis comprende cualquier técnica de separación de macromoléculas mediante un gradiente de potencial eléctrico. Este proceso se basa fundamentalmente en la diferencia de la carga neta de las especies químicas, independientemente del medio de conducción utilizado.

Las Proteínas como Polielectrolitos

Las proteínas actúan como polielectrolitos, ya que poseen grupos electrolíticos que permiten su estudio mediante el comportamiento electroforético. Las cadenas laterales de los aminoácidos constituyen los sitios ionizables de las proteínas; junto a grupos prostéticos como el NAD+, estos elementos aportan significativamente a la carga neta total de la molécula.

Principios de la Electroforesis

El proceso se fundamenta en sumergir dos electrodos en una solución que contiene un electrolito y las moléculas cargadas que se desean separar. Las moléculas cargadas se desplazan hacia el electrodo con signo opuesto a su carga neta. La fuerza de este movimiento depende directamente de la carga de la molécula y de la diferencia de potencial eléctrico aplicado.

Dinámica del Movimiento

• El movimiento produce fricción en las moléculas, las cuales alcanzan su velocidad máxima rápidamente.
• Especies con distinta carga neta presentan una velocidad de migración diferente bajo un potencial eléctrico constante.

Factores que Afectan la Velocidad de Migración

Existen diversos elementos críticos que influyen en la rapidez del proceso:

• Tamaño de la partícula.
• pH del medio.
• Carga neta (la cual afecta el número de cadenas laterales).
• Potencial eléctrico aplicado.
• Características del medio de migración.

Influencia del pH y el Punto Isoeléctrico

Un pH mayor provoca la desprotonación de las moléculas, haciendo que las proteínas adquieran carga negativa y se dirijan hacia el electrodo positivo (ánodo). Por lo tanto, el pH influye tanto en el número como en el tipo de cargas presentes.

• Carga cero: Si la carga es neutra, no se produce migración.
• Solvente con pH sobre el Punto Isoeléctrico (PI): Aumenta la movilidad de la proteína y su carga neta, desplazándose hacia el cátodo. Debido a esto, es fundamental mantener el pH estable mediante el uso de un buffer o solución amortiguadora.

Electroforesis en Gel de Poliacrilamida

En esta técnica, es posible controlar el tamaño del poro según la concentración del gel. Una mayor concentración resulta en un menor tamaño de poro, lo que conlleva una menor velocidad de migración. Además, en este medio, la absorción es despreciable.

Este procedimiento puede realizarse en tubos de vidrio o en placas planas de vidrio. El uso de placas planas se considera superior, ya que permite procesar varias muestras de forma simultánea.

Electroforesis Discontinua

En la electroforesis discontinua, el pH no es uniforme en los geles. Se utilizan comúnmente dos tipos de geles:

1. Gel separador.
2. Gel espaciador: Posee una menor concentración de poliacrilamida, por lo que el tamaño del poro es mayor. Su fuerza iónica es menor, lo que incrementa la resistencia eléctrica y, por consiguiente, aumenta el campo eléctrico.

El movimiento rápido produce la acumulación de material entre los geles, generando bandas definidas durante la migración. El campo eléctrico se expresa en Voltios por centímetro (Volt/cm).

Identificación y Cuantificación de Bandas

Para identificar las bandas resultantes tras la corrida electroforética, se pueden emplear diversos métodos:

• Tinción por inmersión: Tras teñir el gel, este se lava y se utiliza un densitómetro para medir la cantidad de colorante unido, permitiendo así la cuantificación de la muestra.
• Tinción de actividad enzimática: Específica para la detección de enzimas activas.
• Mezclas radiactivas: Se utilizan técnicas de detección avanzada como la fluorografía y la autorradiografía.