Fundamentos de Biología Molecular: Ensayo de Ames y Clonación Genética

Ensayo de Ames: Detección de Mutágenos y su Potencial Genotóxico

El Ensayo de Ames es un ensayo biológico fundamental utilizado para evaluar el potencial mutagénico de compuestos químicos. Su principio se basa en la capacidad de detectar sustancias que causan mutaciones genéticas, ya sea por desplazamiento del marco de lectura o por sustitución de pares de bases del ADN.

Principio del Ensayo

La prueba utiliza cepas de Salmonella typhimurium, construidas mediante ingeniería genética, que son incapaces de sintetizar histidina debido a mutaciones específicas en sus genes. Esto las hace dependientes de un suministro externo de histidina para su crecimiento.

Procedimiento General

1. La prueba emplea varias cepas de Salmonella typhimurium que presentan mutaciones en genes implicados en la síntesis de histidina, lo que las hace auxótrofas para este aminoácido.
2. Las células de prueba están diseñadas para tener una mutación puntual en los genes necesarios para sintetizar histidina, permitiendo la detección de mutágenos que actúan a través de diferentes mecanismos.
3. Las cepas de prueba también llevan mutaciones en los genes responsables de la síntesis del lipopolisacárido, lo que hace que la pared celular de las bacterias sea más permeable a los compuestos químicos.
4. Las bacterias se extienden sobre una placa de agar que contiene una pequeña cantidad de histidina. Esta cantidad limitada en el medio de cultivo permite a las bacterias un crecimiento inicial y les brinda la oportunidad de mutar.
5. Cuando la histidina se agota, solo las bacterias que han revertido su mutación (es decir, han mutado para adquirir la capacidad de producir su propia histidina) sobrevivirán y formarán colonias.
6. La mutagenicidad de una sustancia es directamente proporcional al número de colonias observadas en la placa.

Limitaciones

Dado que Salmonella es una célula procariota, no es un modelo perfecto para predecir la mutagenicidad en seres humanos, que son organismos eucariotas más complejos.

Modificaciones Comunes

Una modificación habitual implica probar directamente la muestra después de un proceso de filtración por membrana, ajustando las concentraciones del agar en la superficie de la placa para optimizar la detección.

Clonación Molecular: Fundamentos y Aplicaciones en Ingeniería Genética

La clonación molecular abarca un amplio conjunto de técnicas cuyo objetivo es la manipulación y replicación de los genes que componen un organismo, desde una bacteria hasta una planta o un ser humano. Es una herramienta esencial en la biotecnología y la ingeniería genética.

Estrategia General de Clonación

1. Aislamiento del ADN Foráneo: Obtención del fragmento de ADN que se desea clonar.
2. Unión al Vector de Clonación: Inserción del fragmento de ADN foráneo en un vector o vehículo de clonación.
3. Introducción en la Célula Hospedadora: Transferencia del vector con el ADN foráneo a una célula receptora.
4. Selección de Células Hospedadoras: Identificación de las células que han incorporado exitosamente el ADN recombinante.
5. Verificación de Estabilidad: Confirmación de que la información genética introducida se mantiene de forma estable y se expresa correctamente.

Detalle de las Etapas Clave

1. Aislamiento del ADN Foráneo

El ADN que se desea clonar puede aislarse mediante diversas estrategias, incluyendo:

• Selección directa desde el genoma que lo contiene.
• Síntesis directa a partir de ARN mensajero (ARNm) mediante retrotranscripción.

2. Vectores de Clonación

Los vectores de clonación son moléculas de ADN con una propiedad indispensable: la capacidad de replicarse autónomamente dentro de una célula hospedadora. Los tipos más comunes incluyen:

• Plásmidos: Son moléculas de ADN circular extracromosómico que se replican de forma independiente del cromosoma bacteriano.
• Virus: Se utilizan virus modificados (como bacteriófagos o virus eucariotas) para introducir ADN foráneo en una célula hospedadora.
• Cósmidos: Son vectores híbridos que combinan características de plásmidos y fagos. La información se introduce en el hospedador por empaquetamiento in vitro, similar a los fagos, pero una vez dentro del hospedador se comportan como un plásmido.

3. Formación del ADN Recombinante y su Introducción

La unión del fragmento de ADN foráneo al vector se produce por la acción de la ADN ligasa, una enzima que sella las mellas (roturas) existentes entre nucleótidos adyacentes. La ADN ligasa más utilizada es la T4 ADN ligasa, que requiere ATP como cofactor. La ligación puede ocurrir entre extremos romos o, más comúnmente, entre extremos cohesivos de ADNs digeridos con la misma enzima de restricción (por ejemplo, EcoRI), lo que permite su apareamiento específico.

La introducción del vector con el fragmento de ADN deseado en la célula hospedadora varía según el tipo de vector y la célula. Los métodos más utilizados incluyen:

• Transformación (para bacterias)
• Transducción (mediante fagos)
• Transfección (para células eucariotas)
• Conjugación
• Fusión de protoplastos
• Microinyección
• Electroporación, entre otros.

4. Selección de la Célula Hospedadora

Una vez introducido el ADN recombinante, es crucial identificar las células que lo han incorporado exitosamente. Principalmente, se emplean dos métodos de selección:

• Resistencia a Antibióticos: El vector de clonación suele contener un gen de resistencia a un antibiótico, permitiendo que solo las células transformadas crezcan en un medio con dicho antibiótico.
• Selección Genética: Incluye técnicas como:
  • Inactivación insercional (por ejemplo, interrupción de un gen reportero como lacZ).
  • Inserción génica positiva (selección de genes que confieren una ventaja de crecimiento).
  • Hibridación de colonias (detección de secuencias específicas de ADN).
  • Otras técnicas genéticas y moleculares.