Fundamentos de Cromatografía: Parámetros Clave para la Separación Eficaz

Introducción a las Técnicas de Separación Cromatográficas

Parámetros Relacionados con la Retención

En cromatografía, la retención de un analito en la columna es un parámetro fundamental. A continuación, se describen los principales:

• Tiempo de retención (t_R): Es el tiempo que transcurre desde el momento en que el analito (B) entra en la columna (t₀) hasta que la mayoría de sus moléculas salen de la columna y alcanzan el detector.
• Tiempo muerto (t_M): Es el tiempo que transcurre desde que un compuesto que no presenta afinidad por la fase estacionaria (A) entra en la columna hasta que la mayoría de sus moléculas salen de la columna y alcanzan el detector. El t_M es igual al tiempo que tarda la fase móvil en recorrer la columna.
• Tiempo de retención corregido (t_R’): Representa la diferencia entre el tiempo de retención y el tiempo muerto (t_R’ = t_R - t_M). Indica el tiempo neto que el analito permanece retenido en la fase estacionaria.
• Coeficiente de distribución (K): En cromatografía, el t_R y el V_R (volumen de retención) están directamente relacionados con la fuerza con la que el analito interacciona con las dos fases, lo que se describe mediante la constante de equilibrio (K). Cuanto mayor sea el valor de K para un analito, mayor será la concentración de este en la fase estacionaria (mayor afinidad del analito por esta fase) con respecto a la fase móvil. Por lo tanto, el analito tardará más en eluir (mayor t_R).
• Factor de retención (k): Este parámetro es independiente de las características específicas de la columna y del flujo. Por ello, es una medida útil para comparar la retención de los analitos en diferentes sistemas cromatográficos.

Parámetros Relacionados con la Eficacia de Separación

La eficacia de un sistema cromatográfico está directamente relacionada con la anchura de los picos obtenidos experimentalmente. Un sistema cromatográfico eficaz es aquel que proporciona picos estrechos.

Los picos estrechos se logran cuando existen pequeñas diferencias en el tiempo que tardan las distintas moléculas de un analito en alcanzar el detector. Puesto que el ancho del pico también depende del t_R, es crucial considerar el Número de platos teóricos (N), que relaciona el t_R de un analito con su anchura. Cuanto mayor sea N, mayor será la capacidad del sistema cromatográfico para separar analitos que difieren poco en su tiempo de retención, resultando en una mayor eficacia y picos más estrechos.

Dado que N depende de la longitud de la columna (L), la Altura de plato o altura equivalente a un plato teórico (H o HETP) se define como H = L/N. Este parámetro permite comparar la eficacia entre columnas de distinta longitud. A menor H, mayor eficacia del sistema.

Factores que Contribuyen al Ensanchamiento de Banda

El ensanchamiento de banda es un fenómeno que reduce la eficacia de la separación cromatográfica. Los principales factores que lo causan son:

Difusión de Eddy (o por Remolinos)

Este fenómeno se debe a los distintos caminos que las moléculas de analito pueden seguir en el interior de la columna. Las moléculas que recorren un camino más corto eluyen antes que aquellas que siguen caminos más largos. Esto provoca un ensanchamiento de banda para cada analito. Para minimizar el ensanchamiento de banda por difusión de Eddy, las partículas de la fase estacionaria deben tener el menor tamaño posible, ser regulares y estar empacadas lo más uniformemente posible. El ensanchamiento de banda debido a la difusión por remolinos es independiente de la velocidad de la fase móvil.

Difusión Longitudinal

Se produce porque las moléculas de analito tienden a difundir desde el centro de la banda, donde la concentración de analito es mayor, hacia los extremos de la banda, regiones donde la concentración es menor. Este ensanchamiento de banda depende de:

• El coeficiente de difusión del analito en la fase móvil.
• La velocidad de la fase móvil.

La contribución de la difusión longitudinal al ensanchamiento de banda es mucho menor en cromatografía de líquidos que en cromatografía de gases, debido a los menores coeficientes de difusión que presentan los analitos en los medios líquidos con respecto a los gases. La contribución de la difusión longitudinal al ensanchamiento de banda es inversamente proporcional a la velocidad de la fase móvil.

Transferencia de Masa

Este tipo de ensanchamiento se produce como consecuencia del distinto tiempo requerido por cada molécula del analito para moverse desde el interior de cada una de las fases (móvil y estacionaria) hacia la interfase donde se produce la transferencia entre ambas. Si las velocidades de transferencia de masa dentro de las dos fases fueran infinitas, este tipo de ensanchamiento no ocurriría. Este ensanchamiento de banda depende de:

• El coeficiente de difusión del analito en la fase móvil y en la fase estacionaria.
• El diámetro de partícula de la fase estacionaria.
• La retención del analito (k).
• La velocidad de la fase móvil (directamente proporcional).