Fundamentos de Esterilización, Cultivo y Tinción en Microbiología Básica

Métodos de Esterilización y Control Microbiano

Definición

Esterilización: Destrucción completa de todos los microorganismos viables, incluyendo formas de resistencia como las esporas bacterianas.

Métodos

Se emplean métodos físicos, químicos y mecánicos para lograr la esterilización, desinfección o antisepsia.

Métodos Físicos

• Calor:
  • Calor Seco:
    • Flameado directo (a la llama): Para material indestructible (asas de siembra) o que se va a desechar.
    • Aire caliente (Horno Pasteur): Esterilización de material de vidrio, polvos, aceites (ej. 160-180°C durante 1-2 horas).
  • Calor Húmedo:
    • Ebullición (Agua hirviendo a 100°C): Destruye formas vegetativas, pero no siempre las esporas resistentes.
    • Vapor fluente (Tindalización): Calentamiento intermitente a 100°C. Útil para instrumental de cirugía sensible, pero no asegura eliminación de todas las esporas.
    • Vapor de agua a presión (Autoclave): Método más eficaz y utilizado. Esteriliza medios de cultivo, material quirúrgico, etc. (Condiciones estándar: 121°C, 1 atmósfera de sobrepresión, 15-20 minutos).
• Radiaciones:
  • Luz solar: Efecto germicida limitado por la radiación UV natural.
  • Luz Ultravioleta (UV): Esterilización de superficies, aire y agua. Baja penetración.
  • Radiaciones ionizantes (Rayos Gamma, Rayos X): Alta penetración. Esterilización industrial de material médico desechable, alimentos.

Métodos Mecánicos

• Filtración: Separación física de microorganismos de líquidos o gases sensibles al calor.
  • Filtros Seitz (de asbesto, en desuso).
  • Filtros de vidrio poroso (sinterizado).
  • Filtros de membrana (ésteres de celulosa, nylon, policarbonato): Los más comunes, con tamaño de poro definido (ej. 0.22 µm para esterilización bacteriana).

Métodos Químicos

• Antisepsia: Aplicación de agentes químicos (antisépticos) sobre tejidos vivos (piel, mucosas) para inhibir o destruir microorganismos (retraso del desarrollo).
• Desinfección: Aplicación de agentes químicos (desinfectantes) sobre objetos o superficies inanimadas para reducir el número de microorganismos patógenos a un nivel seguro. No necesariamente elimina esporas.
• Agentes químicos comunes:
  • Alcoholes (Etanol, Isopropanol al 70%).
  • Cloro y compuestos clorados (Hipoclorito de sodio).
  • Yodo y Yodóforos (Povidona yodada).
  • Fenol y derivados (Cresoles, Clorhexidina).
  • Iones de metales pesados (Nitrato de plata, compuestos de mercurio - uso limitado por toxicidad).
  • Agentes alquilantes (Óxido de etileno - gas esterilizante, Glutaraldehído, Formaldehído).
  • Detergentes (Compuestos de amonio cuaternario).

Medios de Cultivo en Microbiología

Sustratos que aportan los nutrientes necesarios para el crecimiento y multiplicación de los microorganismos in vitro.

Tipos según consistencia

• Líquidos (Caldos): Permiten el desarrollo microbiano en suspensión. Útiles para obtener gran cantidad de biomasa. Ej: Caldo Nutritivo, Caldo Tripticasa Soja.
• Sólidos (Agar): Contienen un agente solidificante (generalmente agar-agar). Permiten el aislamiento de colonias puras y el estudio de su morfología. Ej: Agar Nutritivo, Agar Sangre, Agar Cerebro-Corazón (BHI). Se preparan en placas de Petri o tubos inclinados ("pico de flauta").
• Semisólidos: Menor concentración de agar (0.3-0.5%). Se usan para estudiar la motilidad bacteriana o conservar cepas. Ej: Medio SIM (Sulfuro, Indol, Motilidad), Medio MIO (Motilidad, Indol, Ornitina).

Tipos según composición y uso

• Medios Corrientes, Basales o Simples: Composición sencilla, permiten el crecimiento de muchos microorganismos no exigentes nutricionalmente. Ej: Agar Nutritivo.
• Medios Especiales:
  • Mejorados o Enriquecidos: Medios basales a los que se añaden sustancias nutritivas complejas (sangre, suero, huevo, extracto de levadura) para permitir el crecimiento de microorganismos exigentes. Ej: Agar Sangre, Agar Chocolate.
  • Selectivos: Contienen sustancias (colorantes, sales biliares, antibióticos) que inhiben el crecimiento de ciertos grupos microbianos, favoreciendo el desarrollo de los de interés. Ej: Agar McConkey (sales biliares y cristal violeta inhiben Gram-positivos, selecciona Gram-negativos), Agar SS (Salmonella-Shigella).
  • Indicadores o Diferenciales: Permiten distinguir entre diferentes tipos de microorganismos cultivados en el mismo medio, generalmente por alguna característica metabólica que produce un cambio visible (color de la colonia o del medio). Ej: Agar McConkey (diferencia bacterias fermentadoras de lactosa -colonias rosas- de las no fermentadoras -colonias incoloras-), Agar Sangre (diferencia bacterias según su capacidad hemolítica: alfa, beta o gamma hemólisis).

Ejemplos comunes: Agar Nutritivo (corriente), Agar Sangre (enriquecido y diferencial), Agar McConkey (selectivo y diferencial).

Técnicas de Observación Microscópica y Tinción Bacteriana

Observación en Fresco (Microorganismos Vivos)

Permite observar la morfología, agrupación y motilidad bacteriana.

• Examen directo ("al fresco"): Gota de suspensión líquida entre portaobjetos y cubreobjetos.
• Campo oscuro: Mejora el contraste para observar bacterias finas (espiroquetas).
• Gota pendiente: Para observar motilidad en un ambiente más natural.

Observación de Microorganismos Muertos (Fijados y Teñidos)

Mejora la visualización de las estructuras bacterianas.

• Tinciones Simples: Utilizan un único colorante (ej. Azul de metileno, Cristal violeta). Tiñen todas las células por igual, permitiendo observar morfología y agrupación.
• Tinción Negativa: Tiñen el fondo (el medio circundante), dejando las células sin teñir, transparentes y refringentes. Útil para visualizar cápsulas o bacterias difíciles de teñir. Se usa Tinta china o Nigrosina.
• Tinciones Especiales: Diseñadas para visualizar estructuras bacterianas específicas:
  • Cápsula: Capa externa de polímeros (generalmente polisacáridos) que cubre la superficie de algunas bacterias. Puede ser una red laxa (glucocálix o *slime*) o una estructura definida (cápsula verdadera). Se visualiza mediante tinción negativa (Tinta china) combinada a veces con una tinción simple.
  • Esporas (Endosporas): Estructuras de resistencia altamente deshidratadas, generadas por ciertas bacterias (géneros *Bacillus*, *Clostridium*) en respuesta a condiciones ambientales de estrés (falta de nutrientes, temperaturas extremas). Contienen la información genética necesaria para generar un nuevo individuo viable cuando las condiciones vuelven a ser favorables. Poseen múltiples capas protectoras (córtex, cubierta proteica). Son difíciles de teñir; se usan tinciones especiales como la de Schaeffer-Fulton o Wirtz-Conklin (utiliza Verde Malaquita como colorante primario y Safranina como contraste).
• Tinciones Diferenciales: Utilizan varios colorantes y pasos de decoloración para diferenciar entre distintos grupos bacterianos o entre distintas estructuras de una misma célula.
  • Tinción de Gram: La tinción diferencial más importante en bacteriología. Clasifica a las bacterias en dos grandes grupos según la estructura de su pared celular:
    • Gram-positivas: Retienen el complejo cristal violeta-lugol tras la decoloración y se observan de color violeta.
    • Gram-negativas: Pierden el complejo cristal violeta-lugol con la decoloración y se tiñen con el colorante de contraste (safranina), observándose de color rosa o rojo.

    Pasos de la Tinción de Gram:

    1. Realizar un frotis bacteriano y fijarlo (generalmente por calor).
    2. Cubrir con Cristal Violeta (colorante primario) durante 1 minuto. Lavar con agua.
    3. Cubrir con Lugol (mordiente, forma un complejo insoluble con el cristal violeta) durante 1 minuto. Lavar con agua.
    4. Decolorar con Alcohol-Acetona (o etanol 95%) gota a gota hasta que no arrastre más colorante violeta (paso crítico, ~15-30 segundos). Lavar inmediatamente con agua.
    5. Cubrir con Safranina (colorante de contraste) durante 30-60 segundos. Lavar con agua.
    6. Secar al aire o con papel de filtro y observar al microscopio con objetivo de inmersión (100x).
  • Tinción de Ziehl-Neelsen: Para bacterias ácido-alcohol resistentes (género *Mycobacterium*).

Microbiota Normal del Cuerpo Humano

Conjunto de microorganismos que residen de forma habitual en las superficies (piel y mucosas) de individuos sanos, estableciendo una relación comensal o mutualista.

Piel

La microbiota varía según la zona (seca, húmeda, sebácea). Predominan Staphylococcus epidermidis y otros estafilococos coagulasa-negativos, corinebacterias (difteroides), *Propionibacterium acnes* (en zonas sebáceas). También pueden encontrarse Streptococcus spp., bacilos Gram-negativos y levaduras (*Malassezia*) en menor proporción.

Cavidad Oral

Microbiota muy abundante y diversa. Incluye cientos de especies. Predominan Streptococcus (grupo *viridans*: *S. mutans*, *S. salivarius*, *S. mitis*), anaerobios estrictos (*Veillonella*, *Actinomyces*, *Fusobacterium*, *Prevotella*, *Porphyromonas*), *Neisseria*, lactobacilos, *Haemophilus*, *Mycoplasma*. *Streptococcus pneumoniae* y *Neisseria meningitidis* pueden ser portadores nasofaríngeos.

Tracto Respiratorio

• Vías Altas (nariz, nasofaringe, orofaringe): Colonizadas por microbiota similar a la oral y de la piel.
• Vías Bajas (laringe, tráquea, bronquios, pulmones): Normalmente estériles o con una carga microbiana muy baja transitoria, eliminada por mecanismos de defensa (reflejo tusígeno, aclaramiento mucociliar, macrófagos alveolares).

Tracto Gastrointestinal

• Estómago: Población baja debido al pH muy ácido (pH 1.5-3.5). Pueden sobrevivir microorganismos ácido-tolerantes ingeridos con alimentos o *Helicobacter pylori* (adaptado a este nicho).
• Intestino Delgado (Duodeno, Yeyuno): Microbiota escasa (10³-10⁵ UFC/mL), predominan bacterias ácido-tolerantes como lactobacilos y estreptococos.
• Intestino Delgado (Íleon): Microbiota mixta, densidad moderada (10⁵-10⁸ UFC/mL), similar a la del colon pero en menor cantidad (enterobacterias, enterococos, *Bacteroides*).
• Intestino Grueso (Colon): Ecosistema microbiano más denso del cuerpo humano (10¹¹-10¹² UFC/g de heces). Predominan anaerobios estrictos (>95%), como *Bacteroides*, *Clostridium*, *Bifidobacterium*, *Eubacterium*, *Peptostreptococcus*. También hay anaerobios facultativos como *Escherichia coli* y otras enterobacterias, enterococos.

Conjuntiva Ocular

Microbiota escasa debido al lavado por las lágrimas (que contienen lisozima e IgA). Similar a la de la piel: *Staphylococcus epidermidis*, corinebacterias, estreptococos no hemolíticos.

Tracto Genitourinario

• Vagina: La microbiota varía significativamente con la edad y el estado hormonal (niveles de estrógenos). En mujeres en edad fértil, predominan *Lactobacillus* spp. (bacilos de Döderlein), que producen ácido láctico a partir del glucógeno epitelial, manteniendo un pH ácido (3.8-4.5) que protege contra infecciones. Antes de la pubertad y después de la menopausia, el pH es más neutro y la microbiota es mixta, similar a la de la piel.
• Uretra: La porción anterior (distal) puede estar colonizada por microbiota similar a la de la piel y perineo (*S. epidermidis*, estreptococos, corinebacterias). La uretra posterior, vejiga, uréteres y riñones son normalmente estériles.

Ejemplos de Factores de Virulencia Bacteriana (*Staphylococcus aureus*)

Componentes o estrategias que permiten a una bacteria patógena causar enfermedad.

Enzimas Extracelulares

• Hialuronidasa: Degrada el ácido hialurónico, componente principal de la matriz extracelular del tejido conectivo ("cemento intercelular"), facilitando la invasión y diseminación de la bacteria en los tejidos.
• Fibrinolisina (Estafiloquinasa): Activa el plasminógeno a plasmina, la cual disgrega los coágulos de fibrina, permitiendo la liberación y diseminación de bacterias atrapadas en ellos.
• Coagulasa: Enzima característica de *S. aureus*. Coagula el fibrinógeno del plasma sanguíneo formando una barrera de fibrina alrededor de la bacteria, lo que puede protegerla de la fagocitosis y la acción del sistema inmune.
• Catalasa: Cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno (H₂O₂), un producto tóxico generado por los fagocitos, en agua y oxígeno (se evidencia por la aparición de burbujas en la prueba de la catalasa). Protege a la bacteria del estrés oxidativo.
• Nucleasas (DNasas): Hidrolizan el DNA liberado por células dañadas en el sitio de infección (pus), disminuyendo la viscosidad del exudado y facilitando la movilidad y diseminación bacteriana.
• Lipasas: Hidrolizan lípidos, permitiendo a la bacteria colonizar áreas sebáceas.

Toxinas de Staphylococcus aureus

• Hemolisinas (Citotoxinas):
  • Toxina Alfa (α-hemolisina): Proteína formadora de poros que lisa glóbulos rojos (hemólisis), plaquetas y daña otros tipos celulares (músculo liso, hepatocitos).
  • Otras hemolisinas (Beta, Gamma, Delta).
• Leucocidina (Leucocidina de Panton-Valentine - PVL): Toxina formadora de poros que específicamente degrada leucocitos (neutrófilos) y macrófagos. Asociada a infecciones cutáneas graves y neumonía necrosante.
• Toxinas Exfoliativas (Exfoliatina A y B): Serina proteasas que rompen las uniones intercelulares (desmosomas) en el estrato granuloso de la epidermis, causando el desprendimiento de la capa superficial de la piel (Síndrome de la Piel Escaldada Estafilocócica - SSSS).
• Enterotoxinas (SEA, SEB, SEC, SED, SEE, SEG-SEI...): Proteínas termoestables y resistentes a las enzimas gástricas. Actúan como superantígenos y son la causa de intoxicaciones alimentarias (vómitos intensos, diarrea) tras la ingestión de alimentos contaminados donde la bacteria ha crecido y producido la toxina.
• Toxina del Síndrome del Shock Tóxico (TSST-1): Superantígeno que provoca una activación masiva de linfocitos T, liberando gran cantidad de citoquinas proinflamatorias y causando el síndrome del shock tóxico (fiebre, hipotensión, rash cutáneo, fallo multiorgánico).