Fundamentos de la Fluorescencia Molecular: Principios, Variables e Instrumentación

I: La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de radiación electromagnética. Las especies excitadas se relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energía en forma de fotones.

Teoría de la Fluorescencia Molecular

La relajación vibracional tiene lugar durante las colisiones entre moléculas excitadas y las moléculas del disolvente. Durante estas colisiones, el exceso de energía vibracional se transfiere a las moléculas del disolvente en una serie de etapas. La ganancia de energía vibracional del disolvente se refleja en un ligero incremento de la temperatura del medio. También puede ocurrir el relajamiento no radiante entre el nivel vibracional inferior de un estado electrónico excitado y el nivel vibracional superior de otro estado electrónico, llamado conversión interna.

En la fluorescencia, las bandas de fluorescencia molecular están formadas por una multitud de líneas espaciadas tan estrechamente que son muy difíciles de resolver. Si la desactivación por fluorescencia es rápida con respecto a los procesos sin radiación, se observa tal emisión. La fotoluminiscencia está limitada a un número relativamente pequeño de sistemas. Se observa que las bandas de fluorescencia molecular están formadas principalmente por bandas que tienen longitudes de onda más largas y energías menores que la banda de radiación responsable de su excitación. Este desplazamiento hacia longitudes de onda mayores se llama desplazamiento de Stokes. En aquellos casos en los que la radiación absorbida sea emitida sin cambio en la longitud de onda, se denomina radiación de resonancia o resonancia fluorescente.

Variables que Afectan la Fluorescencia

1. Rendimiento cuántico: Número de moléculas que emiten fluorescencia respecto al número total de moléculas excitadas.
2. Estructura: La fluorescencia más intensa y la más útil es la que presentan los compuestos que contienen grupos funcionales aromáticos. Los compuestos que contienen estructuras alifáticas y alicíclicas de carbonilo o estructuras con dobles enlaces muy conjugados pueden presentar también fluorescencia.
3. Rigidez estructural: Empíricamente se encuentra que la fluorescencia está favorecida en moléculas que poseen estructuras rígidas.
4. Temperatura y disolvente: La fluorescencia disminuye en muchas moléculas con el aumento de la temperatura.
5. Efecto del pH: La fluorescencia de un compuesto aromático con sustituyentes ácidos o básicos en el anillo depende normalmente del pH, requiriendo un control estricto del pH.
6. Efecto de la concentración: La potencia de la radiación fluorescente F es proporcional a la potencia radiante del haz de excitación que es absorbido por el sistema (a mayor concentración, mayor fluorescencia).

Instrumentación en Fluorescencia

1. Fuentes: Normalmente se utiliza una lámpara de arco de xenón o de mercurio.
2. Filtros y monocromadores: En los fluorímetros se utilizan los filtros de interferencia y de absorción; en los espectrofluorímetros se utilizan monocromadores de red.
3. Detectores: La señal de fluorescencia típica es de baja intensidad. Los tubos fotomultiplicadores son los más utilizados.
4. Cubetas: Cilíndricas o rectangulares fabricadas con vidrio o con sílice.

Aplicaciones de la Fluorescencia

Determinación fluorimétrica: Métodos directos que implican la formación de un quelato fluorescente y la medida de su emisión, y un segundo grupo que se basa en la disminución de la fluorescencia que resulta de la acción atenuadora de la sustancia que va a ser determinada.

Determinación fluorimétrica de especies orgánicas y bioquímicas: Incluye el análisis de enzimas, agentes medicinales, productos naturales, esteroides y vitaminas.