Fundamentos y Metodología del Radioinmunoensayo (RIA) en Diagnóstico Clínico

Metodología del Radioinmunoensayo (RIA)

El Radioinmunoensayo (RIA) es un tipo de ensayo clínico que se basa en la competencia entre antígenos marcados (calientes) y antígenos no marcados (fríos) por un número limitado de anticuerpos específicos. El procedimiento se lleva a cabo siguiendo los siguientes pasos:

1. Marcaje de Antígenos: Se marcan los antígenos que se desean estudiar con isótopos radiactivos. Pueden ser emisores de radiación beta, aunque lo más común es que se utilicen emisores de radiación gamma. El isótopo más usado es el ¹²⁵I.
2. Obtención de la Muestra: Se toma una muestra biológica del paciente en la que se encuentra la molécula que se desea estudiar.
3. Antígenos Fríos: Esta molécula es considerada como un antígeno y se denomina antígeno frío porque no está marcado con ningún isótopo radiactivo.
4. Adición de Anticuerpos: Como la molécula es un antígeno, se añade el anticuerpo específico contra ella para que se produzca la reacción Antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac).
5. Combinación de Componentes: Se combina la muestra biológica del paciente (que contiene los antígenos fríos) con una cantidad constante y conocida tanto de anticuerpos como de antígenos calientes.
6. Preparación de Antígenos Calientes: Para conseguir los antígenos calientes, se debe comprar la molécula que es considerada como antígeno y se marca in vitro con los isótopos radiactivos.
7. Competencia: Los antígenos calientes son independientes de los antígenos que contiene la muestra biológica del paciente. Los antígenos fríos del paciente y los antígenos calientes que hemos incorporado van a competir en igualdad de condiciones para unirse con el anticuerpo disponible y formar la reacción Ag-Ac.
8. Variables del Sistema: Las concentraciones del antígeno caliente y del anticuerpo son constantes y conocidas. La única variable del sistema es la concentración del antígeno frío de la muestra del paciente, la cual es desconocida.
9. Relación de Concentración: Cuanto mayor sea la cantidad de antígeno frío en la muestra, este desplazará al antígeno caliente y habrá más unión entre Ag frío-Ac.
10. Cuantificación: Una vez producida la reacción, se analizan las uniones entre Ag frío-Ac y Ag caliente-Ac para determinar la concentración de la molécula que se está estudiando.

Sistemas de Separación de Fracciones en el Radioinmunoensayo

Para poder cuantificar la concentración de la molécula de interés, es fundamental separar la fracción ligada (complejos Ag-Ac) de la fracción libre (antígenos que no se unieron al anticuerpo). Existen tres métodos principales:

1. Adsorción

Se añaden a los pocillos diferentes compuestos, como son el carbón activo, carbón dextrano, silicatos o resinas de intercambio iónico, que adsorben de manera específica la fracción libre y no se unen en ningún caso a los complejos Ag-Ac.

• Se centrifuga la muestra y estos compuestos se sedimentan en el fondo.
• La fracción ligada queda por encima de este sedimento.
• Con mucho cuidado, la fracción ligada se retira y se trasvasa a otro tubo. El sedimento del fondo (fracción libre) se puede desechar.

2. Precipitación Química

Se añaden sustancias como el etanol, el propilenglicol o el sulfato amónico, que alteran la solubilidad de las proteínas provocando su precipitación en el fondo de los tubos. Como los anticuerpos son glucoproteínas, estas sustancias son capaces de actuar sobre ellos y provocar que se precipiten.

• Después, se centrifuga la muestra.
• A diferencia del ejemplo anterior, la fracción ligada se encuentra sedimentada en el fondo del tubo.
• En este caso, el sobrenadante contiene la fracción libre, que se puede desechar, y nos quedamos con el sedimento del fondo para analizarlo.

3. Precipitación Inmunológica

Se utiliza un segundo anticuerpo que se une al primer anticuerpo que habíamos añadido. El complejo que se forma adquiere un gran tamaño y peso molecular, y es capaz de precipitar por sí solo rápidamente.

• De este modo, se centrifuga la muestra.
• La fracción ligada se va a encontrar sedimentada en el fondo del tubo, mientras que la fracción libre permanece en el sobrenadante.
• El sobrenadante se puede desechar y se utiliza el sedimento para analizarlo.