Fundamentos de Microbiología: Preparación de Medios y Técnicas de Identificación Bacteriana

Preparación de Medios de Cultivo

1. Disolución del medio: Disuelve el medio, calentando y agitando (hasta que el medio sólido esté disuelto).
2. Esterilización: Esteriliza el medio en autoclave. El tiempo es según el volumen (ej. 20 minutos a 120ºC).
3. Adición de suplementos: Traslada el medio estéril y añade el suplemento (si es necesario).
4. Dosificación: Dosifica el medio según el tipo de envase requerido, manteniendo condiciones asépticas.

Preparación de Medios Comunes

Agar Sangre

El 6% de sangre mejora el crecimiento de bacterias exigentes y permite la obtención de reacciones hemolíticas (especialmente en estreptococos).

Composición

Digestivo pancreático de caseína, peptona de soja, cloruro sódico, agar. El digestivo pancreático aporta un alto contenido de proteínas.

Preparación

1. Disolver 40g por litro hasta su completa disolución.
2. Esterilizar en autoclave.
3. Enfriar el medio y añadir 5% de sangre de carnero.
4. Dosificar en placa Petri (20 ml por placa). Duración: 2 meses.

Agar Chocolate

Utilizado en procesos cualitativos para el aislamiento y cultivo de microorganismos exigentes.

Composición

Digestivo pancreático de caseína, peptona de carne, almidón de maíz, fosfato dipotásico, fosfato monopotásico, cloruro sódico, agar. La peptona y el digestivo aportan nutrientes nitrogenados. El almidón neutraliza los ácidos tóxicos y ayuda a mantener el pH.

Agar McConkey

Medio diferencial para el aislamiento y diferenciación de microorganismos fermentadores o no fermentadores de lactosa. Si fermentan, el pH disminuye y absorben colorantes (rojo); si no fermentan, permanecen incoloras.

Composición

Digestivo pancreático de gelatina, caseína, peptona, lactosa, sales biliares, cloruro sódico, rojo neutro, cristal violeta, agar. Los digestivos pancreáticos y la peptona son la base nutriente. Las sales biliares no inhiben el crecimiento de enterobacterias. El cristal violeta inhibe las bacterias Gram positivas. El cloruro sódico equilibra la presión osmótica.

Preparación

1. Disolver 50g en 1 litro hasta su completa disolución.
2. Esterilizar en autoclave.
3. Enfriar el medio.
4. Dosificar en placa Petri (4-5ºC).

Agar Mueller Hinton

Utilizado para la comprobación de la susceptibilidad de microorganismos a los antibióticos.

Composición

Infusión de carne, hidrolizado de caseína, almidón, agar. Es transparente. El almidón favorece el crecimiento. La infusión y el hidrolizado aportan nutrientes. Se utiliza con discos de papel antibiótico para observar el halo de inhibición.

Preparación

Disolver 38g en 1 litro, utilizando el mismo método que los anteriores.

Técnicas de Obtención de Cultivos Puros

Es fundamental evitar la contaminación mediante la aplicación de técnicas asépticas durante la inoculación y el trabajo de laboratorio. Para la transferencia de microorganismos, el asa de siembra debe esterilizarse antes de su uso. La boca de los tubos debe flamearse después de destaparse y volverse a tapar inmediatamente.

Tipos de Siembra

1. Siembra en medios sólidos (Placa Petri): El agar se solidifica en la placa. Se utiliza el asa de siembra en zig-zag. Al final, los microorganismos están más aislados, formando cúmulos de colonias (bacterias vivas o unidades formadoras de colonias).
   • Siembra por estría escocesa: Técnica de aislamiento para obtener colonias aisladas.
   • Agotamiento en placa Petri: Permite el crecimiento de un determinado tipo de microorganismo. (Descripción: estría vertical en la placa, zig-zag alrededor de la estría, sin levantar el asa ni rasgar el cultivo).
2. Siembra en medio líquido: La siembra se realiza con una gota de inóculo. Se debe agitar el tubo mediante rotación manual, lo que requiere cierta destreza.
3. Siembra en agar inclinado: Se utiliza un tubo con agar inclinado. El asa toma la muestra y se introduce en el fondo, realizando un zig-zag en la superficie. Tapar e incubar.
4. Siembra por picadura: Se utiliza un asa de bucle en medios sólidos. Se toca el microorganismo aislado y se introduce en el tubo de medio.

Identificación Bacteriana

La identificación se realiza mediante pruebas químicas o serológicas, que varían según el género y la especie.

1. Características del cultivo: Se basan en la morfología bacteriana, tinción Gram, movilidad, propiedades de producción de pigmento y requerimientos especiales.
2. Propiedades bioquímicas: Incluyen la capacidad de atacar o producir compuestos metabólicos. Se realizan en medios simples peptonados. La identificación se basa en tablas de patrones de reacción para cada especie. Si la especie es desconocida, se requieren más pruebas bioquímicas o el uso de lectores automatizados.

Recomendaciones Prácticas para el Uso del Microscopio

1. Mantener una postura adecuada.
2. Colocar la muestra y enfocar con pocos aumentos.
3. Usar gota de aceite solo para el objetivo de 100X (si la muestra está teñida).
4. Ajustar la luz y el diafragma:
   • Muestra teñida: Condensador subido, diafragma abierto.
   • Muestra en fresco: Condensador abajo, diafragma semiabierto.
5. Observar la parte final de la extensión.
6. Si hay interferencias, girar los oculares. Si el problema persiste, limpiar los objetivos o el portaobjetos.
7. Al finalizar, limpiar y cubrir el microscopio con plástico.

Técnicas Especiales de Microscopía

• Fluorescencia: Los compuestos absorben luz y la reflejan en una onda larga. Posee gran importancia biológica.
• Ultravioleta: Utiliza una fuente de luz UV. Los cristales de cuarzo absorben el vidrio. Usa onda corta. Permite tomar fotos, pero es una técnica cara y compleja.

Pruebas Bioquímicas de Identificación

Estas pruebas son esenciales para la identificación de especies.

Batería IMViC

1. Indol: Hidrólisis del aminoácido triptófano por la enzima triptofanasa (presente en enterobacterias). Libera indol. La reacción forma un halo rojo (halo rojo = positivo).
2. Rojo de Metilo (RM): Detecta la formación de ácido acético.
3. Voges-Proskauer (VP): Detecta si el microorganismo produce acetoína durante la fermentación de glucosa. Diferencia E. coli (negativo) de Klebsiella y Enterobacter (positivo).
4. Citrato: Diferencia enterobacterias que pueden utilizar citrato como única fuente de carbono. Se usa el medio Citrato de Simmons (indicador azul). La reacción bacteriana cambia el color de verde a azul.

Otras Pruebas Clave

• Prueba de Catalasa: Detecta bacterias con la enzima catalasa. Se colocan colonias y se añade peróxido de hidrógeno (30%). La aparición de burbujas es positiva.
• Coagulasa: La coagulasa activa el fibrinógeno, formando coágulos.
• Beta-galactosidasa: Detecta la enzima β-galactosidasa en bacterias que fermentan lactosa. Se utiliza un indicador incoloro para diferenciar si fermentan lactosa o no.
• Prueba de DNasa: Detecta la producción de nucleasas. El indicador es verde de metilo y el sustrato es ADN. Una zona clara alrededor de la bacteria indica la hidrólisis del ADN.
• KIA (Kligler Iron Agar): Tubo con indicador de pH (rojo) que es naranja en estado neutro. El color amarillo indica acidez. Permite ver la producción de gas y sulfhídrico (precipitado negro).
  • Glucosa: Fondo amarillo (positivo) / Naranja (negativo).
  • Lactosa: Superior amarillo (positivo) / Naranja (negativo).
  • SH2: Negro (positivo) / Naranja (negativo).
  • Gas: Burbuja o rotura del agar (positivo) / Homogéneo (negativo).