Fundamentos y Reactivos en Radioinmunoensayo: Optimización y Factores Clave

Reactivos Utilizados en Radioinmunoensayo

Reactivos:

• Volumen de alícuota de muestra problema (Agm) o del patrón (Agp).
• Cantidad constante y conocida de Ag/ligando marcado (Ag*).
• Cantidad inferior de Ac específico (Ac).

Blanco

(Se utiliza como referencia): Preparación de concentración 0 con la que se comparan muestras de cada vez mayor concentración de lo que se pretende evaluar.

• Se obtiene: tras la incubación de suero con Ag* sin AC.
• Sirve para:
  • Valorar la unión no específica de Ag*, es decir, posibles errores en Ag* a la hora de formar complejos.
  • Control de falsos positivos.

Procedimiento en Tubos

• El primer tubo no contendrá Ag problema, por lo que todos los complejos se constituirán entre Ac y Ag marcados.
• Los siguientes tubos de ensayo contendrán concentraciones cada vez mayores de muestra, donde puede estar o no el Ag problema. Por tanto, en función de la presencia de dicho Ag natural, la unión del Ac con Ag marcado será menor, puesto que aumentará la competencia entre Ag y Ag*.

Una vez se forman los complejos, tendremos 2 fracciones: Libre (F) y Unida (B).

B0/Bmax

Fracción unida, en la que se ha alcanzado el máximo número posible de complejos entre Ag* y Ac, máxima medición de radiactividad a la hora de medir la actividad.

Incubación

1) Temperatura

Se elige en función de:

• Ag y Ac.
• Tipo de ensayo.
• Características de radioinmunoensayo que queramos destacar como sensibilidad, precisión, etc.

• A mayor Temperatura:
  • Es más fácil que se produzca la unión Ag/Ac.
  • Más rápidamente se separan los complejos Ag/Ac.
• A baja Temperatura: resultados mucho más precisos y fáciles de reproducir.
• A Temperatura ambiente: resultados con sensibilidad muy elevada.

2) Tiempo

Varía en función del ensayo y la temperatura, por lo general, las incubaciones a bajas temperaturas requieren tiempos más largos.

Método de Separación (Unida y Libre)

• Depende de: tipo de ensayo y características F-Q de Ag y Ac.
• Aspectos para escoger:
  1. Que el método escogido consiga la completa separación de ambas fracciones.
  2. Que la separación no se vea afectada por ninguna otra sustancia presente en la reacción.
  3. Que sea un método económico y fácil de producir.
  4. Que sea lo más rápido posible.
  5. Que no interfiera en la reacción Ag/Ac.
  6. No debe alterar las 2 fracciones, ni la estabilidad de los complejos.