Fundamentos de Técnicas de Detección Molecular: Blots (Southern, Northern, Western) y CGH

Fundamentos de Técnicas de Detección Molecular: Blots y Hibridación Genómica Comparada (CGH)

Este documento describe diversas técnicas fundamentales en biología molecular utilizadas para la detección y caracterización de ácidos nucleicos y proteínas. Se abordan métodos de hibridación como el Dot-Blot y sus variantes, así como las técnicas de Southern, Northern y Western Blot, y la Hibridación Genómica Comparada (CGH).

Dot-Blot

El Dot-Blot es una técnica utilizada para detectar la presencia o ausencia de una secuencia de ADN diana específica en una muestra. Sin embargo, no permite determinar el tamaño de dicha secuencia.

ASO Dot-Blot (Oligonucleótidos Específicos de Alelo)

Esta variante del Dot-Blot se emplea para la detección de mutaciones puntuales o polimorfismos de un solo nucleótido (SNP).

• Amplificación del ADN: El ADN de interés se amplifica previamente mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
• Fijación y Hibridación: El ADN amplificado se fija a una membrana, donde se realiza un ensayo de hibridación con sondas de oligonucleótidos específicas de alelo (ASO) marcadas, generalmente de 20 pares de bases (pb).
• Aplicación: Es útil para la detección de mutaciones en genes con un número limitado de variantes alélicas patogénicas conocidas.

Pasos del ASO Dot-Blot:

1. Adición de la sonda marcada específica para el alelo normal a la membrana.
2. Lectura e interpretación del resultado para el alelo normal.
3. Lavado de la membrana y adición de la sonda marcada específica para el alelo patológico.
4. Lectura e interpretación del resultado para el alelo patológico.

ASO Dot-Blot Inverso

Esta técnica es una variante del ASO Dot-Blot convencional, diseñada para el estudio simultáneo de múltiples variantes alélicas de un gen en una única muestra.

• Principio: En esta modalidad, las sondas marcadas y específicas se inmovilizan en la membrana, mientras que el ADN del paciente, previamente marcado, es el que se añade para la hibridación.
• Ventaja: Permite el estudio de múltiples variantes alélicas diferentes de un gen en un solo ensayo.

Pasos del ASO Dot-Blot Inverso:

1. Preparación de la muestra de un único paciente para el estudio de múltiples variantes alélicas (ej. 4 variantes).
2. Inmovilización de las sondas en la membrana: por ejemplo, una sonda marcada para el alelo normal y otra para el alelo patológico, dispuestas en diferentes puntos.
3. Adición del ADN del paciente, previamente marcado, a la membrana para la hibridación.
4. Lavados para eliminar el ADN no unido.
5. Lectura e interpretación del resultado.

Southern Blot

El Southern Blot es una técnica de biología molecular utilizada para detectar una secuencia específica de ADN en una muestra de ADN.

1. Digestión del ADN: El ADN genómico se corta en fragmentos más pequeños utilizando endonucleasas de restricción.
2. Electroforesis: Los fragmentos de ADN se separan por tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa (migración hacia el polo positivo).
3. Desnaturalización: El ADN bicatenario dentro del gel se desnaturaliza a monocatenario utilizando un medio alcalino.
4. Transferencia: El ADN desnaturalizado se transfiere desde el gel a una membrana de nilón o nitrocelulosa, utilizando un medio tamponado.
5. Ensamblaje de Transferencia: Se crea un "sándwich" de transferencia con papel absorbente sobre la membrana y un peso para favorecer el flujo capilar en una cubeta con un tampón de alta fuerza iónica.
6. Hibridación con Sonda: La membrana se incuba con una sonda de ADN marcada (radiactiva o fluorescente) en un medio que contiene sales que favorecen la hibridación, dentro de un recipiente hermético.
7. Hibridación: La sonda se une específicamente a las secuencias complementarias de ADN en la membrana.
8. Detección: Las bandas hibridadas se detectan, comúnmente por autorradiografía o quimioluminiscencia.

Northern Blot

El Northern Blot es una técnica utilizada para el estudio de ARN, que es una molécula monocatenaria, permitiendo detectar la expresión génica a nivel de ARN.

• Preparación de ARN: Se extrae el ARN de la muestra.
• Electroforesis: Las moléculas de ARN se separan por tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida.
• Transferencia: El ARN se transfiere desde el gel a una membrana.
• Hibridación y Detección: Similar al Southern Blot, se utiliza una sonda marcada para detectar secuencias específicas de ARN, seguida de detección por autorradiografía o quimioluminiscencia.

Western Blot

El Western Blot es una técnica fundamental en proteómica para el estudio de proteínas, permitiendo detectar proteínas específicas en una muestra compleja.

1. Electroforesis: Las proteínas de la muestra se separan por tamaño mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE).
2. Transferencia: Las proteínas separadas se transfieren desde el gel a una membrana de nilón o nitrocelulosa.
3. Bloqueo: La membrana se bloquea con una solución (ej. leche desnatada) para evitar la unión inespecífica de los anticuerpos.
4. Incubación con Anticuerpo Primario: La membrana se incuba con un anticuerpo primario (Ac1º) específico para la proteína de interés.
5. Lavados: Se realizan lavados para eliminar el Ac1º no unido.
6. Incubación con Anticuerpo Secundario: La membrana se incuba con un anticuerpo secundario (Ac2º) marcado (ej. con una enzima o fluorocromo) que se une al Ac1º.
7. Lavados Finales: Se realizan lavados exhaustivos para eliminar el Ac2º no unido.
8. Detección: La señal se detecta, comúnmente por quimioluminiscencia o autorradiografía, revelando la presencia y el tamaño de la proteína diana.

Hibridación Genómica Comparada (CGH)

La Hibridación Genómica Comparada (CGH) es una técnica citogenética molecular que detecta ganancias (duplicaciones) o pérdidas (deleciones) de regiones cromosómicas en el genoma.

• Muestras de ADN: Se utilizan dos muestras de ADN genómico: una muestra de estudio (ADN diana) y una muestra de control (ADN de referencia).
• Marcaje Fluorescente: Ambas muestras se marcan con fluorocromos de diferente color (ej. rojo y verde).
• Hibridación Simultánea: Las muestras marcadas se hibridan simultáneamente sobre cromosomas metafásicos normales de un individuo sano.
• Comparación y Detección: La comparación de las intensidades de fluorescencia a lo largo de los cromosomas permite identificar regiones con ganancias (mayor señal de la muestra de estudio) o pérdidas (menor señal de la muestra de estudio) de material genético.

CGH-Array (aCGH)

La CGH-Array (también conocida como aCGH o Hibridación Genómica Comparada basada en microarrays) es una evolución de la CGH convencional que ofrece una mayor resolución.

• Muestras de ADN: Al igual que la CGH convencional, se utilizan dos muestras de ADN genómico (estudio y control).
• Marcaje Fluorescente: Estas muestras se marcan con fluorocromos de diferentes colores.
• Hibridación en Microarray: Se hibridan simultáneamente sobre un portaobjetos que contiene miles de sondas de ADN (microarray).
• Cobertura Genómica: Estas sondas, fijadas en el portaobjetos, cubren de manera exhaustiva todo el genoma o regiones específicas de interés.
• Limitación: Una limitación importante es que no permite detectar alteraciones cromosómicas equilibradas (ej. translocaciones recíprocas o inversiones), ya que no hay ganancia ni pérdida neta de material genético.