Fundamentos y Tipos de Inmunoensayos: Marcadores, Clasificación y Aplicaciones Diagnósticas

Los Marcadores en Inmunoensayos

Las moléculas que actúan como marcador en estas reacciones deben poder unirse al Antígeno (Ag) o al Anticuerpo (Ac) sin alterar su capacidad de reacción. Además, deben tener la posibilidad de ser detectadas y medidas fácilmente. Según el tipo de molécula utilizada como marcador, se aplican distintas técnicas:

1. Enzimoinmunoensayos

   El marcador es una enzima. Para detectarla y medirla, se añade un sustrato sensible a esa enzima, lo que genera una señal medible.

2. Inmunocromatografías

   El marcador son nanopartículas coloreadas, generalmente de metales pesados (como el oro coloidal).

3. Fluoroinmunoensayos

   Utilizan la propiedad que tienen algunas sustancias de emitir fluorescencia cuando son excitadas con energía radiante. En este caso, el marcador es un fluorocromo.

4. Radioinmunoensayos

   El marcador es un isótopo radiactivo. Estas técnicas presentan algunos inconvenientes que derivan de la necesidad de usar isótopos radiactivos, dado que son peligrosos y requieren instalaciones adecuadas.

Clasificación de los Inmunoensayos

Además de la clasificación en función del tipo de marcador, los inmunoensayos pueden clasificarse aplicando otros criterios:

Inmunoensayos Competitivos y No Competitivos

Para determinar un Ag en una muestra, se añade el Ac correspondiente y, además, una cantidad determinada del mismo Ag marcado. De esta manera, el Ag marcado y el Ag de la muestra competirán por el Ac. Posteriormente, se mide la cantidad de Ag marcado que no ha reaccionado, la cual es inversamente proporcional a la cantidad de Ag presente en la muestra.

Inmunoensayos Heterogéneos y Homogéneos

Según la técnica que se use, el resultado se puede medir de distintas formas: bien directamente (homogéneos) o bien retirando del medio las moléculas que no se han conjugado (heterogéneos).

Inmunoensayos Enzimáticos Multiplicados (EMIT)

Estas técnicas utilizan una enzima conjugada con el analito de interés como marcador en una reacción enzimática-sustrato. La reacción inmunológica tiene lugar en un medio líquido y se basa en una reacción competitiva entre el Ag de la muestra y el mismo Ag marcado con una enzima.

Fluoroinmunoensayos

Son aquellos que utilizan como marcadores sustancias capaces de emitir fluorescencia cuando son excitadas con energía radiante. Existen distintas modalidades:

Técnicas de Inmunofluorescencia

En esta técnica, la visualización del complejo Ac-Ag no es inmediata, sino que se lleva a cabo por intervención de sustancias fluorescentes acopladas a un Ac. El complejo Ag-Ac formado se pone de manifiesto por observación del portaobjetos en el microscopio de fluorescencia. Para aplicar la microscopía de fluorescencia se necesita una iluminación intensa y de longitud de onda corta, lo que se consigue con una lámpara de luz UV.

Fluoroenzimoinmunoensayo (FEIA)

Esta técnica es una variante de la técnica de ELISA ligada a fluorescencia y se utiliza, por ejemplo, para detectar Salmonella y Listeria en solo 45 minutos.

Radioinmunoensayo (RIA)

Son inmunoensayos que utilizan isótopos radiactivos como marcadores; la molécula marcada se llama trazador. El principio de esta técnica es la inhibición competitiva de la unión de un Ag radiactivo a su Ac específico por parte del Ag no marcado. Cuanto mayor sea la cantidad de Ag no marcado en la muestra, menor será la cantidad de trazador que se une al Ac.

Inmunoensayos Quimioluminiscentes

Utilizan sustratos quimioluminiscentes que emiten luz cuando se produce la reacción enzimática. La emisión de luz se mide con un espectrofotómetro de quimioluminiscencia. Son compuestos químicos que emiten luz cuando se oxidan, como el luminol, el éster de acridino y la lucigenina.

Inmunocromatografías

Se utiliza con frecuencia porque es sencilla de manejar y de interpretar los resultados. Es un tipo de inmunoensayo en el que se usan como marcador nanopartículas coloreadas, que pueden ser metales pesados. La técnica consiste en:

1. Colocar la muestra que se va a analizar en la zona de siembra de la tira de nitrocelulosa.
2. Se deja que la muestra fluya por capilaridad y llegue a la zona del conjugado, donde se encuentra el Ac marcado. Si en la muestra hay Ag, se forma el complejo Ag-Ac.
3. Ese complejo sigue migrando por la tira y llega a la zona de detección, donde se forma una banda coloreada (rosa o azul, dependiendo de la nanopartícula utilizada).
4. Realizar la lectura del resultado.