Ingeniería Genética: Herramientas y Aplicaciones

Introducción

Biotecnología: Utilización de seres vivos para obtener productos útiles para el ser humano.

Ingeniería genética: Conjunto de técnicas basadas en la manipulación del ADN de los seres vivos.

Básicamente se trata de transferencia de secuencias de ADN de unos organismos a otros. Muchas de las técnicas de la ingeniería genética se basan en el uso de ADN recombinante. El ADN recombinante se forma por unión de fragmentos de ADN que originalmente están separados. Habitualmente, se trata de fragmentos de ADN pertenecientes a células de individuos diferentes, incluso de especies diferentes.

La manipulación del ADN tiene múltiples aplicaciones:

• Medicina: terapia génica, obtención de proteínas humanas, vacunas…
• Obtención de organismos transgénicos: individuos con características especiales (distintas a la de su especie).
• Clonación de determinadas especies.
• Investigación básica…

Instrumentos y Técnicas de Ingeniería Genética

La manipulación del ADN obliga a utilizar “instrumentos” de su misma escala (a escala molecular).

Enzimas

Determinados tipos de enzimas se utilizan a modo de “tijeras” para ”cortar” el ADN. Por ejemplo, para obtener secuencias (fragmentos) concretas de ADN (genes), se utilizan:

a) Enzimas de restricción (o endonucleasas de restricción)

Reconocen una secuencia concreta de bases de la hebra de ADN y la cortan en ese punto. Los cortes realizados en la hebra de ADN provocan la aparición de:

• Extremos romos (rectos).
• Extremos cohesivos (permite la unión posterior de este gen en otra molécula de ADN cortada previamente por el mismo enzima).

b) Transcriptasa inversa

Enzima propio de retrovirus (H.I.V. y otros). Estos retrovirus poseen genoma de ARN. Utilizan la Transcriptasa inversa para sintetizar hebras de ADN, tomando como molde su genoma de ARN (al revés de lo que dicta el dogma central de la biología molecular).

Esta propiedad se puede aprovechar en laboratorio para obtener genes (doble cadena de ADN) a partir de un determinado ARNm (mensajero): si se tiene el ARNm proveniente de un determinado gen, se puede usar la transcriptasa inversa para obtener la doble hebra de ADN de la que procede el ARNm (es decir, se obtiene el gen correspondiente a ese ARNm). A este gen así obtenido se le denomina ADNc (ADN complementario).

c) Polimerasas

d) Ligasas

Bacterias, Plásmidos y Virus

a) Bacterias y plásmidos

Las bacterias son seres vivos unicelulares con estructura celular procariota. Tienen un tamaño mucho menor que las células eucariotas (habitualmente de 1 a 10 μm. de diámetro). No tienen núcleo diferenciado, por lo que el material genético (genóforo), formado por ADN doble y circular, se sitúa libre en el citoplasma. Algunas bacterias poseen además plásmidos en su citoplasma, que son pequeñas moléculas de ADN doble y circular independientes del genóforo. Tanto el ADN principal como los plásmidos se utilizan en I.G. como “receptores” de otros fragmentos de ADN (genes de otros seres vivos) obtenidos previamente, para:

a) Obtener muchas copias de dicho gen insertado rápidamente (clonación del gen): Si se inserta un determinado gen en el ADN de una bacteria, al reproducirse ésta, todas las bacterias descendientes (al ser clónicas), poseerán una copia del mismo gen insertado.

b) Utilizarlos como vectores: sistemas de transporte para transferir genes insertados en el genoma de una bacteria, por ejemplo, a las células de otros seres vivos. ¿Cómo?: infectando estos últimos con la bacteria que hace de vector.

b) Virus

Son los microorganismos acelulares (es decir, no poseen una estructura celular) más conocidos. Tienen un tamaño muy pequeño (10 a 300 nm). Se consideran parásitos obligados intracelulares (en células eucariotas o procariotas), ya que, al no poseer metabolismo propio, necesitan parasitar células (introducirse en ellas) para realizar su propia reproducción.

Su ciclo reproductivo se denomina “ciclo lítico”. Tras adherirse a la superficie celular se introducen en la célula. Después, liberan su genoma en el citoplasma. A partir de aquí, utilizan la “maquinaria” celular de replicación, transcripción y traducción para sintetizar gran cantidad de sus propias moléculas (proteínas, ácidos nucleicos…). Tras ello, en la célula infectada se ensamblan cientos de nuevos virus (viriones), que posteriormente salen de la célula (provocando su muerte) para repetir el proceso de reproducción. En su ciclo reproductivo (lítico) pasan por lo tanto, por:

• fase acelular: periodo fuera de las células, en la que son inertes.
• fase celular: periodo en el interior de las células.

Pueden infectar bacterias (virus bacteriófagos o fagos), células animales (v. animales) y vegetales (v. vegetales). Provocan numerosas enfermedades infecciosas, al provocar habitualmente la muerte de la célula que parasitan. En I.G. también se utilizan los virus como vectores de genes extraños. Se insertan los genes de interés en el genoma del propio virión, y luego se provoca que éste infecte una determinada célula, para conseguir así que el gen insertado pase a la célula.

Para estos y otros usos en I.G., los investigadores aprovechan procesos que de manera natural realizan estos microorganismos.

• Transformación: Incorporación por bacterias de ADN libre en el medio de forma natural.
• Transducción: Transferencia de genes entre bacterias a través de virus que los han infectado consecutivamente.
• Conjugación: Intercambio de genes entre bacterias por medio de plásmidos

Ejemplos:

• Bacteriófago o fago λ: Se trata de virus que infectan bacterias. Se sustituye una parte de su genoma de ADN por el gen que se quiere insertar en una bacteria. Al infectar la bacteria, introducen en el genoma bacteriano su ADN + el gen artificialmente insertado.
• Agrobacterium tumefaciens: Bacteria que produce tumores en vegetales. Se utiliza como vector para introducir genes en plantas. Posee un plásmido (Ti) capaz de insertarse en el ADN de la célula vegetal que infecta. Insertando un gen de interés en el plásmido, es posible hacer que la bacteria, al infectar la célula vegetal, lo transfiera al genoma de la célula.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Técnica desarrollada hace 40 años. Desde entonces se utiliza para conseguir una gran cantidad de copias de ADN a partir de una cantidad minúscula. Se trata por lo tanto de un proceso de clonación de ADN in vitro. Está basado en la utilización de enzimas de ADNpolimerasa obtenidas de bacterias termófilas (y que, por lo tanto, no se desnaturalizan con el calor).

Supuso un salto importante para el desarrollo posterior de la ingeniería genética, ya que permite amplificar la cantidad de ADN de muestras minúsculas, (por ejemplo, en la identificación de restos humanos). En los últimos años se ha popularizado por su aplicación en los test para detectar el virus causante de la Covid-19. La técnica consiste en repetir un ciclo de tres etapas (Ver vídeo):

1. Desnaturalización del ADN de la muestra (un gen, por ejemplo): Se calienta a 94º C, separándose así las dos hebras de la doble hélice de ADN.
2. Hibridación de cebadores: Se añaden cebadores (segmentos pequeños de ADN en este caso) y disminución de temperatura (54ºC), para que se unan a las hebras de ADN separados previamente.
3. Elongación de la cadena: (72ºC) El ADNpolimerasa sintetiza una hebra complementaria a partir de los cebadores utilizando las hebras antes separadas como moldes.

El resultado es la obtención de dos moléculas de ADN de doble hélice.

El ciclo se repite una y otra vez. En cada ciclo se obtiene, por lo tanto, el doble de la cantidad de ADN. La repetición continuada del ciclo hace que la cantidad de ADN crezca de

forma exponencial: Cantidad de copias = 2n (n = número de ciclos realizados), y se obtengan así millones de copias del gen en poco tiempo. Durante la pandemia de la Covid 19 escuchamos continuamente hablar de las pruebas PCR para detectar personas infectadas por el virus. Para poder detectar si una persona tiene el genoma del virus en su cuerpo y, por lo tanto, estar infectado, necesitan aumentar la cantidad de copias del genoma del virus en la muestra, ya que si no sería indetectable (en el caso de que estuviera el virus). Para ello utilizan el PCR. En este caso, el genoma del virus es de ARN (hebra simple), por lo que primero han de transformar ese genoma de ARN en doble hebra de ADN, utilizando la transcriptasa inversa . Posteriormente amplifican el ADN obtenido (genoma del virus en forma de ADN) con el PCR, y así puede ser detectado. 

2.4. La tecnología CRISPR-Cas.

Es una reciente herramienta de edición del genoma que permite modificar el ADN de los seres vivos. Actúa como unas “tijeras moleculares” capaces de cortar en un punto muy concreto de la secuencia de ADN del genoma. Esto permite que luego se puedan insertar nucleótidos concretos en ese lugar, modificando así la secuencia de bases. Supone una revolución en la ingeniería genética, ya que con esta tecnología se puede editar, corregir, alterar, el genoma de cualquier célula de una manera fácil, barata, rápida y muy precisa. Está basada en un sistema de defensa natural que utilizan las bacterias para defenderse de los virus. Cuando un virus infecta a una bacteria, esta última incorpora una pequeña porción del ADN del virus en sus propias regiones o secuencias CRISPR de su ADN. Después, si el mismo virus intenta infectar nuevamente, el sistema CRISPR-Cas reconoce esa misma secuencias específica y la proteína Cas corta el ADN viral, desactivándolo. El sistema CRISPR-Cas consta de dos elementos esenciales:

-Operón Cas: Secuencia con ADN con información genética para codificar las endonucleasas Cas y otras proteínas relevantes

-Región CRISPR: está formada por secuencias cortas de ADN repetidas, intercaladas con pequeñas secuencias espaciadoras. Estas secuencias son las porciones de ADN de virus que la bacteria ha incorporado anteriormente.

Cuando un virus infecta una bacteria por segunda vez, ésta expresa la endonucleasa Cas. Además, transcribe los ARN de las secuencias espaciadoras. La enzima Cas se combina con este ARN y lo utiliza como guía. Entonces se dirige al ADN del virus que ha infectado la célula, y la guía de ARN se unirá de manera absolutamente específica a la secuencia de ADN del virus (son complementarios). La enzima Cas entonces cortará el ADN del virus, inutilizándolo. Para utilizar CRISPR-Cas9 para editar un determinado gen en el laboratorio, los científicos primero diseñan y sintetizan una guía de ARN que se una a la secuencia de ADN del gen que desean editar (complementaria). Después, introducen la guía de ARN y la proteína Cas9 en la célula que desean editar.

3. APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA.

1.OBTENCIÓN DE ORGANISMOS TRANSGÉNICOS.

Organismos transgénicos (u organismos modificados genéticamente OMG) son aquellos seres vivos cuyo material genético ha sido modificado por ingeniería genética. Puede implicar técnicas de inserción de genes de una especie en el genoma de otra diferente. El objetivo es que dicho organismo posea alguna característica diferente al resto de individuos de su especie

a) Ejemplo: Obtención de bacterias transgénicas con el objetivo de que produzcan proteínas de interés terapéutico, como insulina humana, hormona del crecimiento, etc. El procedimiento simplificado sería el siguiente: 1.Obtener el gen de la insulina humana, por ejemplo, cortándolo del ADN humano por medio de enzimas de restricción.

2.Seleccionar una especie de bacteria que posea plásmidos.

3. Extraer el plásmido y cortar los plásmidos con el mismo enzima de restricción.

4.Poner en contacto los fragmentos de ADN (gen de la insulina) con los plásmidos cortados para que se incorporen al plásmido.

5.Insertar el plásmido en la bacteria. A partir de ese momento, la bacteria posee el gen de la insulina humana insertado en el ADN de su plásmido (ADNrecombinante), por lo que cada vez que se divida, las células hijas poseerán también dicho gen.

6.Las bacterias se cultivan en medios adecuados. En poco tiempo se generan colonias de billones de bacterias clónicas que, al expresar el gen insertado artificialmente, producen grandes cantidades de insulina humana.

Es un proceso típico de clonación de un gen determinado.

b) Ejemplo: Obtención de planta transgénica resistente a determinado herbicida. El objetivo es obtener un cultivo de determinada especie vegetal transgénica, que contiene un gen que le confiere resistencia a un determinado herbicida (al rociar el cultivo con ese herbicida se mueren el resto de vegetales, las malas hierbas, pero la especie transgénica no se ve afectada). La bacteria utilizada como vector es “Agrobacterium Tumefaciens”.

1.El gen insertado pertenece a otra especie bacteriana al que, obviamente, le confiere resistencia frente al herbicida.

2.Una vez insertado el gen en el plásmido de Agrobacterium (pasos realizados como en el ejemplo a), la bacteria Agrobacterium, que actúa como vector, se pone en contacto con células de la planta (es decir, se infecta la planta con Agrobacterium tumefaciens que contiene en su plásmido el gen que confiere resistencia al herbicida). En algunas células infectadas, el plásmido con el gen de interés es capaz de insertarse en el genoma celular.

3.Las células vegetales con el gen insertado de esta manera se cultivan en medios hidropónicos: se forman plantas completas transgénicas (todas sus células contienen el gen que aporta resistencia al herbicida)..

Se han obtenido así maíz y soja resistente a herbicidas, a plagas, tomates que maduran más tarde, arroz con gran cantidad de vitamina A, etc.

c) Ejemplo: obtención de especies animales transgénicos.

Es bastante más compleja que con vegetales.

Se está trabajando sobre todo con peces, ya que resulta más fácil la inserción de genes en el zigoto de estos animales por microinyecciones de ADN. En estos casos, se han conseguido especies de peces de piscifactoría con crecimiento rápido, al introducir el gen de la hormona de crecimiento de otras especies, etc. Se trabaja con conseguir mamíferos (vacas, ovejas transgénicas) que produzcan en la leche proteínas (medicamentos) de interés. Así, luego resulta muy sencillo obtener dicha molécula.

También se trabaja con ratones transgénicos. En este caso se utilizan para realizar diferentes experimentos de ciencia básica.

3.2 TERAPIA GÉNICA.

Se trata de introducir genes “sanos” en personas que poseen algún gen defectuoso (mutado) que les está produciendo algún tipo de enfermedad genética, con el objetivo de que se corrija la función del gen defectuoso y la persona se cure. Para insertar el gen se utilizan determinados virus modificados. Primero se inserta el gen sano en el genoma vírico. Estos, tras infectar las células humanas, insertan su ADN (que contiene el gen “sano” en el genoma celular (por medio del ciclo lisogénico)

Se ha intentado utilizar este método en determinadas enfermedades genéticas que provocan inmunodeficiencia (caso de los “niños burbuja”).

Todavía está en los inicios y suelen surgir problemas:

El gen se inserta en el cromosoma humano en cualquier sitio, al azar, por lo que pueden ocurrir alteraciones genéticas. Se han dado casos en los que los pacientes tratados han desarrollado tumores. En otros casos no ha habido mejoras. Actualmente se están llevando a cabo distintos ensayos clínicos de terapias génicas. Por ejemplo, utilizando células madre del paciente en el que se ha modificado el gen defectuoso. En este caso, el sistema de edición de genes CRISPR/Cas9 parece muy prometedor.

3.3CLONACIÓN.

a) Clonación reproductiva:

Se trata de obtener individuos genéticamente idénticos.

En el caso de las plantas es un proceso natural, cada vez que se reproducen asexualmente. En animales el proceso es más complejo, ya que en los tejidos animales no suelen existir células madre adultas totipotentes (capaces de dar lugar por división y especialización a cualquier tipo celular e incluso a un individuo completo), como sí ocurre en vegetales. En 1997 se obtuvo la primera oveja clónica (Dolly) por medio de una técnica llamada transferencia nuclear somática:

Se obtuvo una célula de la glándula mamaria de una oveja (Oveja A) y se extrajo su núcleo (diploide). Se extrajo un óvulo de otra oveja (oveja B) y se le extrajo su núcleo haploide.

El núcleo de la oveja A se fusionó con el óvulo eunucleado de la oveja B (sin núcleo). Al fusionarse ambos, se formó un cigoto diploide, con núcleo (y por lo tanto, ADN) de la oveja A. Se consiguió que este cigoto comenzara su desarrollo embrionario. Se implantó el embrión en el útero de una tercera oveja (oveja C). Tras el embarazo nació una oveja clónica a la oveja A. Uno de los objetivos de la clonación de animales es conseguir cientos o miles de individuos idénticos, por ejemplo, ovejas transgénicas que produzcan alguna proteína humana en la leche.

b) Clonación terapéutica:

Otro objetivo a largo plazo es la clonación de tejidos u órganos humanos (no individuos, que está totalmente prohibido) con el objetivo de curar enfermedades. En este caso, se trata por ejemplo, de buscar una solución al problema del rechazo que se produce en los casos de trasplantes de órganos o tejidos.La solución sería obtener células del propio enfermo y clonarlas en el laboratorio, haciéndolas crecer en cultivos, y especializarse o diferenciarse hasta formar el tejido u órgano que se necesita para ser trasplantado al paciente. Se evitaría así el rechazo, ya que serían células del propio receptor. El problema es que no se pueden utilizar las células adultas del individuo, puesto que ya están diferenciadas (especializadas), por lo que no se podrían especializar en otras. Para ello se necesitan células madre pluripotentes (células madre embrionarias a partir de las que se pueden obtener distintos tipos celulares, para así generar distintos tejidos).

*Las células madre totipotentes (células embrionarias durante las primera fase del desarrollo embrionario), a diferencia de las anteriores, pueden generar un individuo completo.

Ejemplos:

1. Uso de células madre embrionarias:

Son células pluripotentes, es decir, son capaces de dar lugar a distintos tipos de célula, pero no se solucionaría el problema del rechazo ya que pertenecerían a otro individuo. Para superar este problema se podría realizar la técnica de la transferencia nuclear somática (Dolly) utilizando un núcleo del propio receptor. Sin embargo, el uso de células madre embrionarias planteó un problema ético, ya que obliga a destruir embriones humanos. Parte de la sociedad considera que un embrión es ya un ser humano con la misma protección desde el punto de vista legal que cualquier persona nacida. Además, se ha demostrado que el uso de este tipo de células provoca la aparición de tumores en el enfermo, por lo que se descartó su uso y se ha optado por investigar con otros tipos de células. En 2001 se descubrió que algunas Células madre adultas (células multipotentes, que están en determinados tejidos de un individuo adulto y tienen capacidad de generar algunos tipos celulares, como por ejemplo, las células de la médula ósea), son capaces de transformarse en distintos tipos celulares, en función de las condiciones del medio de cultivo en el laboratorio.

2. Uso de Células IPS (células madre pluripotenciales inducidas).

En 2006, Yamanaka (premio Nobel en 2012) consiguió que una célula adulta (diferenciada o especializada) se trasformara en célula madre pluripotencial, insertando una serie de genes de su genoma. A partir de esta célula reprogramada se podían obtener células de diferentes tejidos.

Se considera un paso muy importante, y de hecho deja atrás la investigación con células madre embrionarias. Tienen aplicaciones como modelos para estudio de enfermedades, posibles usos terapéuticos, disminuyendo el rechazo en los trasplantes y sin la controversia del uso de embriones, e investigaciones básicas.

3.4 OBTENCIÓN DE GENOTECAS.

Se trata de obtener colecciones de genes individuales separados unos de otros, a modo de “biblioteca” de genes. Los genes se aíslan o separan de los cromosomas con enzimas de restricción y posteriormente se insertan en vectores (plásmidos de bacterias, etc.). Las bacterias se cultivan en medios adecuados (placas de Petri, etc.). El resultado es la obtención de colonias de bacterias individuales, de manera que cada una de estas colonias posee un gen concreto. Facilita el trabajo en laboratorio, puesto que permite tener a mano el gen que se requiere en cada caso.

4. EL PROYECTO GENOMA HUMANO. SECUENCIACIÓN DEL ADN. HUELLA GENÉTICA.

Se trata de un proyecto desarrollado entre 1990 y 2003, impulsado desde gobiernos de distintos países, y llevado a cabo por un numeroso grupo de laboratorios. Paralelamente fue realizado por un grupo privado (Celera Genomics). Los objetivos principales eran:

-Secuenciación del ADN: Descifrar la secuencia completa de nucleótidos del genoma humano (3.000 millones de pares de bases). 

-Identificar todos los genes que se encuentran en los 23 cromosomas de un juego haploide humano.

La técnica era muy compleja: se basaba en “trocear” las muestras de ADN y posteriormente conseguir secuenciar (deducir el orden de nucleótidos) de cada fragmento. Posteriormente había que hallar dónde se “situaba” cada uno de los fragmentos (en qué cromosoma y en qué lugar exacto del cromosoma). A partir de ello se desarrolló una rama de la ciencia conocida como genómica, que se encarga del estudio de los genomas de los seres vivos. Otra rama relacionada es la proteómica, que estudia el conjunto de proteínas de un individuo.  Se descubrió que poseemos entre 20.000 y 25.000 genes (menos de lo que se calculaba previamente)  Un porcentaje de ADN muy pequeño (2 %) corresponde con exones que se expresan a proteínas (genes codificantes). El 40 % corresponde a intrones, promotores, genes que codifican otros ARN y zonas junto a genes importantes para la regulación y el control de la transcripción.

4.1. LA HUELLA GENÉTICA.

Una parte del resto del ADN está formada por una serie de secuencias cortas repetidas (STR, del inglés short tandem repeats, pequeñas repeticiones en tándem), cuya función es en la actualidad desconocida. Son regiones cortas del ADN, de 2 a 6 pares de nucleótidos, repetidas una detrás de otra un determinado número de veces (normalmente menos de 50). También se denominan microsatélites. Estas secuencias han permitido desarrollar la técnica de la “huella genética” que permite identificar, por comparación, a qué individuo pertenece una determinada muestra biológica. Se descubrió que el número de veces que se repiten algunas de estas secuencias cortas en distintos cromosomas es característico de cada individuo (polimorfismos). Ésta es la característica que permite determinar lo que se conoce como “huella genética” de un individuo.

La huella genética es mucho más precisa que la huella dactilar, y de hecho se utiliza habitualmente en pruebas de paternidad, o como prueba en crímenes en los que se hallan muestras orgánicas  (sangre, semen…) pertenecientes a algún sospechoso, etc.

La técnica se basa en la ordenación por tamaño de fragmentos de ADN de un individuo. Como cada persona tiene un número concreto de repeticiones de estas secuencias en sus cromosomas, los tamaños de estas zonas del ADN será diferente de una persona a otra.

Para obtener la huella genética, por medio de la técnica del PCR se amplifica la muestra de ADN “problema” (la que queremos identificar a quién pertenece), que contiene estas secuencias repetidas características de cada persona. Posteriormente el ADN obtenido se “trocea” con determinados enzimas (hay que recordar que cada enzima de restricción corta en lugares concretos del ADN).

La muestra obtenida ahora posee una mezcla de fragmentos de ADN de diferente tamaño. Estos fragmentos posteriormente se separan entre sí por la técnica conocida como electroforesis :

Se trata de una placa de gel en la que se sitúa la muestra de fragmentos de ADN en un extremo. Se hace pasar una corriente eléctrica por la placa. Los fragmentos de ADN se moverán por la placa en función de su carga eléctrica y de su masa molecular (lógicamente, cuanto mayor o más pesada sea, menos se moverá). El resultado es la separación de los fragmentos  de ADN por tamaños.

Se obtiene una serie de franjas formadas por fragmentos de ADN, separadas a diferentes distancias unas de otras en función del tamaño: en cada franja se sitúan fragmentos iguales de ADN (mismo tamaño = misma movilidad)..Como cada persona tiene STRs diferentes (repetidos más o menos veces, los fragmentos de ADN obtenidos de cada persona serán de distinto tamaño, por lo que tras la electroforesis, la separación de los fragmentos tendrán un patrón diferente en cada persona.  Es una especie de “código de barras” que resulta ser específico de cada individuo, ya que como antes se ha comentado, el número de repeticiones de los STR situados en estos fragmentos son características de cada individuo. Para saber a quién pertenece esa muestra de ADN, hay que comparar la huella genética obtenida con la huella del “sospechoso”. 

Los beneficios que puede traer el proyecto Genoma Humano tienen que ver con:

El diagnóstico y prevención de determinadas enfermedades (si se detecta que una persona es susceptible a padecer determinada enfermedad se podrían tomar medidas necesarias para evitarlo).

-Terapias génicas futuras.

También puede generar desventajas o problemas, ya que si se puede realizar un análisis completo del genoma de cada individuo, habrá que decidir hasta qué punto la información obtenida es privada, o si dicho análisis debe ser  obligatorio o no (por ejemplo, a la hora de contratar un seguro de vida podría generar problemas el hecho de que el análisis detectase la susceptibilidad de una persona a sufrir determinada enfermedad, etc.).