Inmunoanálisis: Técnicas RIA e IRMA para la Detección de Antígenos

Inmunoanálisis No Competitivo

Hay exceso de anticuerpos en fase sólida, al que se une el antígeno. El antígeno, cuyos niveles van a ser determinados, reacciona con dos anticuerpos distintos, marcados y no marcados, de forma que queda unido a modo de sándwich entre ambos.

Se necesitan:

• Un ANTISUERO con anticuerpos marcados específicos del antígeno unidos a fase sólida.
• Una muestra del paciente con el antígeno no marcado.
• Un antisuero señal con anticuerpos marcados (Ac*) y libres, capaces de unirse a un segundo determinante antigénico del antígeno.

Durante la incubación el antígeno reacciona primero con los anticuerpos de captura, quedando retenido en la fase sólida. Luego, el Ac* reconoce el complejo, uniéndose al antígeno a través de un epítopo distinto.

Radioinmunoanálisis (RIA)

Mediante RIA podemos cuantificar cualquier sustancia que se comporte como antígeno, es decir, que sea capaz de desarrollar la producción de anticuerpos. Existen dos tipos fundamentales de métodos:

• RADIOINMUNOANÁLISIS CLÁSICO (RIA): es de tipo heterogéneo competitivo.
• ANÁLISIS INMUNORRADIOMÉTRICO (IRMA): es de tipo heterogéneo no competitivo.

Fundamentos del RIA Competitivo

El RADIOINMUNOANÁLISIS se basa en una reacción antígeno-anticuerpo, en el que se va a producir una COMPETICIÓN de dos sustancias antigénicas iguales, por su unión al anticuerpo. Los anticuerpos deben ser específicos contra la sustancia que queremos determinar y tener una gran afinidad.

La cantidad de anticuerpo añadida al análisis es limitada e inferior a la cantidad de antígeno total, por lo que la mezcla va a quedar saturada con él. Además del antígeno presente en la muestra problema (ANTÍGENO FRÍO o NO MARCADO), se añade una cantidad constante y conocida de antígeno marcado (ANTÍGENO CALIENTE). Los dos tipos de antígenos van a competir en igualdad de condiciones por unirse con el anticuerpo disponible. Las concentraciones de antígeno marcado y de anticuerpo son constantes. La única variable del sistema es la concentración del antígeno no marcado, es decir, la muestra problema.

Cuanto mayor sea la cantidad de antígeno frío en la muestra problema, este desplazará al antígeno caliente y, por tanto, se fijarán al anticuerpo cantidades menores del antígeno marcado. La formación de complejos radiactivos (Ag-Ac*) varía en función de la concentración del antígeno no marcado: a mayor concentración de éste, mayor formación de complejos antígeno-anticuerpo no marcados, y menor formación de complejos radiactivos, y viceversa.

Análisis Inmunorradiométrico (IRMA)

El ANÁLISIS INMUNORRADIOMÉTRICO (IRMA) surgió de la posibilidad de marcar el anticuerpo para evitar la pérdida de estabilidad y eficacia que sufre el antígeno al ser marcado radiactivamente. La zona en la que se marca el anticuerpo con el radionucleido, se encuentra alejada de la zona inmunorreactiva del anticuerpo, evitando así interferencias. El IRMA puede ser:

• IRMA HETEROGÉNEO: competitivo o de inhibición.
• IRMA NO COMPETITIVO: o tipo sándwich.

IRMA No Competitivo o Tipo Sándwich

En esta técnica incubamos el anticuerpo unido a una fase sólida en exceso con el antígeno problema. Se forma un complejo Ag-Ac que se incubará posteriormente con un segundo anticuerpo, también en exceso, que se encuentra marcado con un radionucleido. Obtenemos un complejo Ag-Ac-Ac* marcado, llamado COMPLEJO SÁNDWICH. Se forman tantos complejos sándwich como permita la cantidad de antígeno presente en la muestra problema. La separación del anticuerpo marcado no unido se hace por decantación y lavado, y a continuación se realiza el contaje. Los anticuerpos utilizados deben ser monoclonales, ya que estos permiten reconocer distintas zonas del antígeno, y deben estar en exceso.