Interpretación del Medio Kligler y Técnicas de Cultivo para Clostridium y Enterobacteriaceae

Interpretación de Resultados en Medio Kligler (KIA)

El medio Kligler Iron Agar (KIA) se utiliza para la diferenciación de bacilos entéricos Gram negativos basándose en la fermentación de carbohidratos y la producción de sulfuro de hidrógeno.

Lectura de Resultados:

• Fermentación de la glucosa: Fondo del tubo de color amarillo.
• No fermentación de glucosa: Fondo del tubo de color rojo (sin cambios, SC).
• Fermentación de la lactosa: Superficie inclinada (pico de flauta) de color amarillo.
• No fermentación de lactosa: Superficie inclinada alcalina (color rojo).
• Producción de gas: Presencia de burbujas en la masa del medio; a veces, se observa rotura o desplazamiento del agar.
• Producción de H₂S (Sulfuro de hidrógeno): Ennegrecimiento de la zona, usualmente en la interfase del fondo y el pico de flauta, o a lo largo de la línea de siembra por picadura.

Identificación de Clostridium Sulfito-Reductores

Este procedimiento se enfoca en la detección de formas vegetativas y esporuladas de Clostridium capaces de reducir sulfitos.

Procedimiento de Siembra y Cultivo:

1. Por duplicado, se siembra 1 ml de cada dilución utilizando una pipeta estéril en tubos que contienen el medio SPS (Sulfito Polimixina Sulfadiazina) previamente acondicionado.
2. La siembra se realiza introduciendo la pipeta con el inóculo hasta el fondo del tubo y depositándolo lentamente de abajo hacia arriba.
3. Una vez realizada la siembra en cada tubo y para cada dilución, se obtura la superficie del medio con una capa de parafina estéril para crear condiciones anaeróbicas.
4. Una vez solidificada la parafina, los tubos se llevan a la estufa en una jarra de anaerobios y se incuban a 46°C durante 24-48 horas.
5. Lectura de resultados: Se considera una prueba positiva (+) la aparición de colonias negras, lo cual indica la reducción de sulfito a sulfuro.

Fundamento del Medio Selectivo (SPS):

El medio SPS es selectivo para gérmenes sulfito-reductores:

• El sulfito sódico presente en el medio es reducido a sulfuro por estas bacterias.
• El sulfuro resultante reacciona con el citrato de hierro (también presente en el medio), formando sulfuro de hierro. Este compuesto se manifiesta como un precipitado negro característico alrededor de las colonias.
• La sulfadiazina sódica es un componente selectivo que inhibe el crecimiento de gérmenes Gram negativos. La polimixina, también presente en el medio SPS, contribuye a la selectividad general del medio.

Métodos para Cultivo en Anaerobiosis:

Para asegurar el crecimiento de microorganismos anaerobios como Clostridium, se pueden emplear los siguientes métodos:

• Utilización de jarras para anaerobios con sistemas generadores de atmósfera anaerobia.
• Obturación del medio de cultivo sembrado con una capa de parafina estéril.
• Siembra en la profundidad del medio (por ejemplo, en tubos altos de agar).

Detección e Identificación de Enterobacteriaceae Totales

Las Enterobacteriaceae constituyen una amplia familia de bacilos Gram negativos de gran importancia en diversos campos.

Características Generales de Enterobacteriaceae:

• Morfología: Bacilos (forma de bastón).
• Tinción de Gram: Gram negativas.
• Metabolismo respiratorio: Aerobias y anaerobias facultativas.
• Esporulación: No forman esporas (no esporuladas).
• Motilidad: Pueden ser móviles (generalmente por flagelos perítricos) o inmóviles.
• Metabolismo de carbohidratos: Fermentan la glucosa, produciendo ácido.
• Reducción de nitratos: Reducen los nitratos a nitritos.
• Prueba de oxidasa: Citocromo oxidasa negativas (-).
• Tolerancia: Crecen en medios de cultivo que contienen sales biliares.

Géneros de importancia incluyen: Salmonella, Shigella y Escherichia.

Procedimiento Microbiológico para Enterobacteriaceae:

1. Preenriquecimiento (Resucitación)

Se parte de una suspensión madre del alimento o muestra en un caldo nutritivo no selectivo, como el caldo Triptona Soja (TSB). Esta etapa permite la recuperación de células bacterianas que pudieran estar dañadas.

2. Enriquecimiento Selectivo

A partir de la suspensión madre (o del caldo de preenriquecimiento), se realizan diluciones y se inoculan en un medio de enriquecimiento selectivo. Por ejemplo, se preparan tres series de cinco tubos, cada uno conteniendo 10 ml de caldo de enriquecimiento EE de Mossel (Caldo para Enriquecimiento de Enterobacterias según Mossel).

3. Aislamiento en Medio Selectivo y Diferencial

De los tubos que muestren crecimiento (positivos +) en el caldo de enriquecimiento, se siembra por estría sobre la superficie de un medio selectivo y diferencial como el agar Bilis Rojo Violeta Glucosa (VRBG). Las placas se incuban a 37°C durante 24 horas.

• Fundamento del VRBG: Las sales biliares y el cristal violeta presentes en el medio inhiben el crecimiento de la flora Gram positiva y de muchos microorganismos Gram negativos no entéricos (flora competitiva).
• Todas las Enterobacteriaceae fermentan la glucosa con producción de ácido. Esto se manifiesta por un viraje del indicador de pH (rojo neutro) al rojo y la precipitación de las sales biliares alrededor de las colonias, otorgándoles una apariencia característica (colonias de color rosa a rojo, a menudo con un halo de precipitado).

4. Pruebas Confirmativas

De las colonias típicas (sospechosas de ser Enterobacteriaceae) crecidas en el agar VRBG, se toma una porción y se siembra sobre un agar nutritivo no selectivo, como el agar PCA (Plate Count Agar), para obtener un cultivo puro. Se incuba a 37°C durante 24 horas. A partir de este cultivo puro, se realizan las siguientes pruebas bioquímicas:

• Prueba de Citocromo Oxidasa:

  Se coloca una pequeña porción de la colonia sobre un papel de filtro Whatman impregnado con unas gotas del reactivo de oxidasa (p. ej., N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilendiamina dihidrocloruro). Una reacción positiva se evidencia por el desarrollo de un color violeta oscuro o púrpura en pocos segundos. Las Enterobacteriaceae son característicamente oxidasa negativas (no hay cambio de color o este es muy tardío).

• Prueba del Kligler (KIA - Kligler Iron Agar) o TSI (Triple Sugar Iron Agar):

  Se siembra una colonia aislada en un tubo con medio Kligler (o TSI). La siembra se realiza por estría en la superficie inclinada (pico de flauta) y por picadura en el fondo del tubo. Se incuba a 37°C durante 24 horas. La lectura de los resultados se realiza siempre a las 24 horas para interpretar la fermentación de azúcares (glucosa y lactosa en KIA; glucosa, lactosa y sacarosa en TSI), la producción de gas y la producción de H₂S (consultar la sección inicial sobre Interpretación del Medio Kligler).