Mecanismos de Mfn2 en la Regulación del Estrés del Retículo Endoplasmático y la Función Mitocondrial

Hallazgos Clave sobre Mfn2 y la Respuesta Celular al Estrés

• En Mfn2 KO, no se inducía apoptosis, sino que las células morían por paraptosis (una forma alternativa de muerte celular) inducida por estrés del retículo endoplasmático. Esto se determinó mediante citometría de flujo (anexina V) y la medición de la expresión de ALIX (proteína necesaria para la apoptosis). Conclusión: Mfn2 participa en la respuesta normal al estrés del retículo.
• Mfn2 KO muestra una disminución de la autofagia en respuesta al estrés.
• Se realizó inmunodetección para LC3b1 y LC3b2. El estrés del retículo endoplasmático provocó un aumento de LC3b2 en células WT. En Mfn2 KO no se observó un aumento de LC3b2; además, el uso de bafilomicina replicó este resultado. La reexpresión de Mfn2 en células KO restituyó los niveles normales de LC3b2. Conclusión: Mfn2 participa, de una u otra forma, en la autofagia o en la formación del autofagosoma.
• Posteriormente, se realizó un experimento con mCherry y el pH lisosomal, observándose mediante microscopía de fluorescencia una disminución generalizada: reducción de la formación del autofagosoma, disminución de la abundancia de lisosomas y menor formación del autofagolisosoma.
• Para complementar, se midieron los niveles de transcritos de Beclin 1 y LC3b, los cuales se encontraron disminuidos en Mfn2 KO.

Deficiencia de Mfn2 desregula las vías PERK, IRE-1 y ATF6 en respuesta al estrés

Los gráficos de la Figura 4 revelan las siguientes conclusiones:

• Se observó que en Mfn2 KO aumenta la cantidad de pPERK, y junto a esto, aumentó la cantidad de CHOP y los niveles de GADD34. Conclusión: Mfn2 reprime la vía PERK.
• También se observó un aumento en los niveles de ATF4 y XBP-1.
• Mediante ensayos de luciferasa, se midió la respuesta transcripcional de ATF6, observándose un aumento en Mfn2 KO. Conclusión: Mfn2 regula la Respuesta a Proteínas Desplegadas (UPR) en el estrés del retículo endoplasmático (RE).

Deficiencia de PERK mejora la apoptosis y la pérdida de XBP-1 mejora la autofagia durante el estrés del retículo en Mfn2 KO

Se utilizó un lentivirus con shRNA para PERK, XBP-1 y ATF6, mostrando resultados solo para el knockdown (KD) de PERK.

• Se utilizó inmunodetección para observar la activación de caspasa 3. Se observó que, en ausencia de PERK (KD), había un aumento de la activación de caspasa 3, y aun así, no aumentó la cantidad de LC3b. Conclusión: PERK podría regular la apoptosis, pero no la autofagia.

La deficiencia de Mfn2 causa una activación sostenida de PERK que media la morfología y función mitocondrial

La pérdida de función de Mfn2 causa una activación sostenida de PERK, caracterizada por una fosforilación de PERK y eIF2α en las tres líneas celulares (MEF, C2C12, 3T3-L1). También se observó una sobreactivación en células hepáticas y musculares Mfn2 KO, junto con un aumento en la expresión de CHOP (Figura 7A-B).

Los autores sugieren una posible interacción física entre PERK y Mfn2. A través de inmunoprecipitación, descubrieron que, efectivamente, existe una interacción física entre PERK y Mfn2, lo cual es coherente con el modelo de regulación negativa sobre PERK. Se observaron alteraciones mitocondriales en el calcio, en la producción de ROS, entre otros. Al reexpresar Mfn2, se rescató el fenotipo normal, lo que sugiere que la sobreactivación de PERK en ausencia de Mfn2 es la que provoca estos efectos.

Para comprobar lo anterior, se silenciaron PERK, XBP-1 y ATF6, y solo se observó un rescate parcial del fenotipo normal al silenciar PERK. También se realizó en las mutantes Mfn1 KO, donde no se observó cambio alguno, por lo que los cambios mitocondriales son atribuibles a la sobreactivación de PERK en ausencia de Mfn2 en Mfn2 KO.