Medición de la actividad enzimática y determinación de electrolitos

Medición de la actividad enzimática

Factores que influyen en la actividad enzimática

Tampón de la muestra:

• Temperatura: 37 grados es la temperatura óptima de la enzima. Conseguimos que el centro activo de la enzima tenga una forma idónea para unirse al sustrato.
• pH: El pH debe ser óptimo de forma que el centro activo tenga la forma idónea para unirse a su sustrato. Si el medio es ácido, los aminoácidos básicos captarán protones y crearán cargas positivas. Estas cargas positivas pueden atraer o repeler aminoácidos situados en otras zonas de las proteínas y modificar su forma.
• Adición de cofactores: Ayudan a la función de la propia enzima, ayudan a adquirir la forma adecuada de su centro activo. Pueden ser coenzimas o grupos prostéticos.
• Reacciones acopladas: Cuando en la reacción, con sustrato, no hay ni reactivos ni productos que absorban en el espectro visible UV, se utiliza una segunda e incluso tercera reacción, de forma que los productos de la anterior sean los reactivos de la siguiente, y así se produzca un aumento o disminución de la absorbancia con el tiempo.

Metodología de medición

Se mide o bien la aparición de un producto, o la desaparición de un sustrato u otro reactivo. Esto se traduce en un aumento o disminución de la absorbancia. (fórmula). En los protocolos se indica el momento en el que se empieza a medir. A partir de ahí se pueden realizar una o más medidas cada minuto. A continuación, se realiza la diferencia entre la medida de absorbancia al principio y al final de cada minuto. Con la medida de las diferencias ya podremos multiplicar por el factor que nos dice el protocolo y calcular la actividad.

Determinación de electrolitos

Técnicas fundamentales para la determinación de electrolitos:

• Sodio (Na): Fotometría de llama o electrodo selectivo (más práctico).
• Calcio iónico (Ca2+): Electrodo selectivo.
• Calcio total: Métodos colorimétricos, espectrofotometría V-W.

Determinaciones básicas de electrolitos

• Sodio y potasio: Por electrodos selectivos de iones, por fotometría de llama o por técnicas colorimétricas.
• Calcio iónico: Mediante electrodo selectivo de iones.
• Calcio total: Por técnicas colorimétricas, fluorimétricas o espectrofotometría de absorción atómica.

Potenciometría

Fundamento: Medición de la diferencia de potencial entre los electrodos de una celda formada por un electrodo sensible al analito (electrodo indicador) y un electrodo patrón (electrodo de referencia). La diferencia de potencial será directamente proporcional a la cantidad de analito.

Medidas de Potenciometría:

• Basadas en gasometría: medición de pH, medición de pCO2.
• Basadas en ISE: medición de Na+, K+ y calcio iónico. Ejemplo: electrodo de Severinghaus para determinar pCO2.

Amperometría

Medición de la corriente (amperios) entre dos electrodos en los que se ha establecido una diferencia de potencial (electrodo de referencia y electrodo indicador) directamente proporcional a la cantidad de analito. Se establece una diferencia de potencial constante. Ejemplo: electrodo de Clark para determinar pO2.